特異体質性薬物性肝障害における免疫学的因子の作用機序解明と予測試験系の開発研究

文献情報

• 文献番号: 201307007A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: 特異体質性薬物性肝障害における免疫学的因子の作用機序解明と予測試験系の開発研究
• 課題番号: H23-バイオ-一般-001
• 研究年度: 平成25(2013)年度
• 研究代表者(所属機関): 横井 毅(国立大学法人 名古屋大学 大学院医学系研究科)

研究分担者(所属機関)

• 中島　美紀(国立大学法人　金沢大学　医薬保健研究域薬学系)
• 深見　達基(国立大学法人　金沢大学　医薬保健研究域薬学系)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 創薬基盤推進研究
• 研究開始年度: 平成23(2011)年度
• 研究終了予定年度: 平成25(2013)年度
• 研究費: 30,000,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

医薬品の開発において、安全な薬の開発と使用を妨げる主な課題は、ヒト特異的に発現する予測困難な毒性・副作用にあると言っても過言ではない。医薬品による重篤な副作用の中で薬物性肝障害の例は多く、候補化合物の開発試験が途中で断念することや、上市後に間もなく販売停止に至ることは、製薬会社のみならず患者や社会にとって大きな損失である。特に最近FDAが、解決すべき最重要課題としている「ヒト特異的薬物性肝障害の発現の早期解決」が切望されている。近年、肝障害の原因となる反応性代謝物の生成量をin vitroで精査する手法が急速に一般化したものの、薬物性肝障害の予測性は向上していないことが認識されるようになってきた。その主な原因は、danger signalと言われる肝障害発症における様々なリスク因子の中で、免疫学的因子の関与が全く考慮・評価されていないことに起因しているが、こうした視点からの研究はこれまで殆ど行われていない。我々はこの問題を解決し、我が国の創薬に資することを目的として研究を進めた。本研究成果により、臨床試験段階または市販後に肝障害で開発が断念されることを防ぐことが高い確率で期待でき、我が国の医薬品開発に資すること大であると考えられるとともに、患者の利益を向上させるなど、極めて社会性が高い研究であると考えられる。

研究方法

ヒトにおいて肝障害性が知られている臨床薬であるフェニトイン、カルバマゼピン、アザチオプリン(AZA)、フルクロキサシリンについて、薬の吸収と血中濃度を十分に考慮した投与方法を発案した。ハロタンに対してイソフルラン、ジクロフェナクにはイブプロフェン、フルタミドにはビカルタミド、ジクロキサシリンにはアンピシリンを用いて、正常マウスに肝障害を惹起させる遺伝子の発現変動を、薬理学的効果に由来する変動と区別できる系として、対照群として検討し、免疫・炎症因子関連のバイオマーカーを選択した。さらに、このバイオマーカーをin vitroのcell-basedの試験系への適用の検討を行った。すなわち、ヒト肝ミクロゾームで反応性代謝物を生成させ、マクロファージ由来細胞を標的細胞として、遺伝子の発現変動の検討を行った。

結果と考察

フルクロキサシリン誘導性肝障害モデルマウスにおいて免疫学的因子が発症および増悪に関与していることを明らかにした。その中でもhigh mobility group box 1 (HMGB1)とToll like receptor (TLR)4が関係するシグナル伝達が発症に関与している可能性、さらにIL-17が増悪因子である可能性を示すことができた。フェトイン誘導性肝障害を確立することに成功し、複数の自然免疫因子の有意な発現上昇が見られ、血漿中high-mobility group box (HMGB) 1タンパク質の上昇が認められた。獲得免疫系でも有意な発現上昇及び、血漿中IL-17タンパク質の上昇が認められた事から、Th17細胞の関与も示唆された。ABTの投与によりALT値の有意な低下が認められ、代謝的活性化の関与を明らかにした。また、AZA誘導性肝障害においては、キサンチンオキシダーゼにより触媒される反応によって産生されるROSが、酸化ストレスの要因となりAZAの肝毒性を惹起する可能性が示された。自然免疫の活性化が認められた。また、HMGB1の血漿中タンパク質濃度は、AZA投与により経日的な上昇が認められた。AZA投与後の肝臓において、抗ミエロペルオキシダーゼ抗体陽性細胞が認められころ等から、AZA誘導性肝障害に好中球の肝臓への浸潤を伴った炎症反応が関与することが示唆された。このように個々の薬によって肝障害の発症機序が異なるものの、Th2、Th17または自然免疫系が主に関与する3種類に分類することができると考察出来た。In vitroのcell-basedの検討の結果としてS100A8、S100A9、RAGE、IL-1βおよびNALP3が複数の薬物性肝障害に共通して発現量の増加が認められ、これらの因子が免疫を介した肝障害を予測する毒性マーカーとして有用である可能性が示唆された。

結論

当初の計画とおり、予定していた複数の肝障害薬について動物モデルを確立することができた。さらにその発症機序を解析し、個々の薬物で異なるものの、３種類に大別出来ることが明らかになった。４種類の肝障害薬の動物モデルとその対照群の肝障害に伴う肝遺伝子発現の比較から、mRNAで測定できるバイオマーカーを5種類選択することができ、これをヒトin vitro cell-based の系に応用し、リスク評価試験系として報告した。さらなる検討によって特異体質性肝障害薬の明確なリスク評価が可能になるものと考える。

公開日・更新日

• 公開日: 2015-03-03
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201307007B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: 特異体質性薬物性肝障害における免疫学的因子の作用機序解明と予測試験系の開発研究
• 課題番号: H23-バイオ-一般-001
• 研究年度: 平成25(2013)年度
• 研究代表者(所属機関): 横井 毅(国立大学法人 名古屋大学 大学院医学系研究科)

研究分担者(所属機関)

• 中島　美紀(国立大学法人　金沢大学　医薬保健研究域薬学系)
• 深見　達基(国立大学法人　金沢大学　医薬保健研究域薬学系)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 創薬基盤推進研究
• 研究開始年度: 平成23(2011)年度
• 研究終了予定年度: 平成25(2013)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

医薬品の開発において、安全な薬の開発と使用を妨げる主な課題は、ヒト特異的に発現する予測困難な毒性・副作用にあると言っても過言ではない。なかでも薬物性肝障害の発生例は現在でも少なく無く、候補化合物の開発試験が中断する場合や、上市後に間もなくの販売停止は、製薬会社のみならず患者や社会にとって大きな損失である。近年、特異体質性肝障害発症の引き金は、薬物代謝酵素による反応性代謝物の生成である場合が多く、その量をin vitroで精査する手法が急速に一般化したものの、薬物性肝障害の予測性は向上していないことが認識されるようになってきた。その主な原因は、danger signalと言われる肝障害発症における様々なリスク因子の中で、免疫学的因子の関与が全く考慮・評価されていないことに起因しているが、こうした視点からの研究はこれまで殆ど行われていない。我々はこの問題を解決し、我が国の創薬に資することを目的として研究を進めた。本研究成果により、臨床試験段階または市販後に肝障害で開発が断念されることを防ぐことが高い確率で期待でき、我が国の医薬品開発に資すること大であると考えられるとともに、患者の利益を向上させるなど、極めて社会性が高い研究であると考えられる

研究方法

ヒトにおいて肝障害性が知られている臨床薬であるジクロフェナク、フルタミド、ハロタン、フルクロキサシリン等については、単回投与によって、フェニトイン、カルバマゼピン、アザチオプリンについては、5日間の連投によって、肝障害マウスモデルの作出を検討した。薬の吸収と血中濃度を十分に考慮した投与方法を発案した。また、ハロタンに対してイソフルラン、ジクロフェナクにはイブプロフェン、フルタミドにはビカルタミド、ジクロキサシリンにはアンピシリンを用いて、正常マウスに肝障害を惹起させる遺伝子の発現変動を、薬理学的効果に由来する変動と区別できる系として、対照群として検討し、免疫・炎症因子関連のバイオマーカーを選択した。さらに、このバイオマーカーをin vitroのcell-basedの試験系への適用の検討を行った。すなわち、ヒト肝ミクロゾームで反応性代謝物を生成させ、マクロファージ由来細胞を標的細胞として、遺伝子の発現変動の検討を行った。さらに、マイクロRNAが極めて初期のバイオマーカーになる可能性など、多くの項目について研究を遂行した

結果と考察

3年間の研究期間中に臨床で肝障害の注意喚起などがなされている薬10種類について肝障害モデルマウスを初めて確立することができた。従来アセトアミノフェンのみが研究対象であった世界が大きく変わると考えられる。7種類は急性毒性、3種類は連投による亜急性の肝障害モデルである。発症機序解析の結果、3種類に大別できることが示唆された。Th2細胞が関与する獲得免疫系、Th17が関与する系、そしてCD4+がほとんど関与しない自然免疫系因子が関与する系である。これにより、今後のin vivoの包括的な予測試験系の確立が可能になると思われる。また、免疫関連細胞を標的細胞としたin vitroのスクリーニング系のバイオマーカーの選択にとっても有用な結果である。すなわち、本研究では5種類の遺伝子をmRNAレベルで検討できる免疫/炎症関連因子を考慮したバイオマーカーとして、論文報告を行った。しかし、明瞭な区別にはまだ至って居ないが、この研究アプローチのさらなる検討によって、より予測性が高いin vitroの系になることが期待できると考えられる。また、肝障害発症時に極めて早期に発現が変動するマイクロRNAについて検討した結果、Th17細胞によって増悪するハロタン誘導性肝障害のメカニズムをマイクロRNAの変動から予測する系が可能であることを示した。また、女性に肝障害が重篤化する傾向があるが、その原因の一つがプロゲステロンであることを報告し、さらにそのシグナル伝達も明確にした。

結論

当初の計画どおり多くの臨床薬について肝障害動物モデルを確立することができた。さらにその発症機序を解析し、個々の薬物で異なるものの、機序は3種類に大別出来ることが明らかになった。４種類の肝障害薬の動物モデルとその対照群の肝障害に伴う肝遺伝子発現の比較から、mRNAで測定できるバイオマーカーを5種類選択することができ、これをヒトin vitro cell-based の系に応用し、リスク評価試験系として報告した。さらなる検討によって特異体質性肝障害薬の明確なリスク評価が可能になるものと考える。

公開日・更新日

• 公開日: 2015-03-03
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201307007C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: アセトアミノフェンのみであった肝障害動物モデルにカルバマゼピンやフェニトインなど10種類の薬について、モデル動物を作出し、発症機序によって分類することができた。その成果に対して、2014年に国内外から総説依頼が多く、招待講演も多くなっている。また、製薬会社からの個別相談もあり、解決すべき薬物性肝障害の事例は多い。ヒトにおけるリスクの予測性の検証が急がれる
• 臨床的観点からの成果: 2013年12月にPhase III 臨床試験後期に肝障害で開発を断念した武田薬品（株）のfasiglifamは、現在でも医薬品開発における肝障害予測の困難さを示した。また、分子標的薬や核酸医薬もヒトにおける肝障害が主たる副作用であり、開発撤退の主な理由の一つであることは有名であり、これらのリスクを予測できるように、in vitroの系を深化させる必要がある。現状では、まだ種差を充分に検証していないため、ヒト由来試料を用いた系の開発を指向する必要がある
• ガイドライン等の開発: 平成20年4月に厚生労働省から出された「重篤副作用疾患別対応マニュアル 薬物性肝障害」に本研究で検討した10種類の薬について何らかの記載がなされている。しかし発症機序として、Th2やTh17の関与などの機序は述べられておらず、旧来のアレルギー性と分類されている。近い将来ヒトにおける炎症/免疫因子の関与の検証データを取得した後、記載内容の追加が必要と思われる。それにより肝障害の回避と治療に有益な情報を与えると考えられる
• その他行政的観点からの成果: 創薬は分子標的薬、核酸医薬や抗体医薬にシフトしているが、いずれもヒト特異的免疫・炎症を介した肝障害が主たる副作用の一つとして、開発中断の理由になっている。創薬のターゲット探索と平行して、開発確率を上げるための、安全な薬の開発手法の研究も重要であると考えられる。
• その他のインパクト: 2012年7月17日の日経バイテクONLINEトップニュースとして、「薬剤性肝炎の発症にTh17やTh2の関与が次々と明らかに」という表題で、本研究課題における成果である免疫が関連する機序を明らかにするバイマーカーの選択について詳しく紹介された。本記事は、その週のアクセス数のbest 3に入いる関心を持たれた。

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 57件
• その他論文(和文): 8件
• その他論文(英文等): 6件
• 学会発表(国内学会): 92件
• 学会発表(国際学会等): 26件
• その他成果(特許の出願): 0件
• その他成果(特許の取得): 1件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

特許

• 特許の名称: 肝保護作用を有するタンパク質、肝障害予防・保護用化合物のスクリーニング方法
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 5688229 ; 発明者名: 横井 毅、吉川幸孝 ; 権利者名: 名古屋大学 ; 出願年月日: 20100319 ; 取得年月日: 20150130 ; 国内外の別: 国内

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Azusa Yano, Shingo Oda, Tsuyoshi Yokoi et al.; Development of a cell-based assay system considering drug metabolism and immune- and inflammatory-related factors for the risk assessment of drug-induced liver injury.; Toxicology Letter , 228 (1) , 13-24 (2014); 10.1016/j.toxlet.2014.04.005.
• 原著論文2: Shinya Endo, Azusa Yano, Tsuyoshi Yokoi et al. ; Involvement of miRNAs in the early phase of halothane-induced liver injury.; Toxicology , 319 (1) , 75-84 (2014); 10.1016/j.tox.2014.02.011.
• 原著論文3: Shohei Takai, Tatsuki Fukami, Tsuyoshi Yokoi et al.; Involvement of immune- and inflammatory-related factors in flucloxacillin-induced liver injury in mice.; Journal of Applied Toxicology , 35 (1) , 142-151 (2015); DOI 10.1002/jat.3002
• 原著論文4: Kentaro Matsuo, Eita Sasaki, Tsuyoshi Yokoi et al.; Involvement of oxidative stress and immune- and inframmation-related factors in azathioprine-induced liver injury. ; Toxicology Letters , 224 (2) , 215-224 (2014); 10.1016/j.toxlet.2013.10.025.
• 原著論文5: Taishi Miyashita, Miki Nakajima, Tsuyoshi Yokoi et al.; Evaluation and mechanistic analysis of the cytotoxicity of the acyl glucuronide of nonsteroidal anti-inflammatory drugs. ; Drug Metabolism and Disposition , 42 (1) , 1-8 (2014); 10.1124/dmd.113.054478.
• 原著論文6: Eita Sasaki, Tatsuki Fukami, Tsuyoshi Yokoi et al.; A novel mouse model for phenytoin-induced liver injury: involvement of immune-related factors and P450-mediated metabolism.; Toxicological Sciences , 136 (1) , 250-263 (2013); 10.1093/toxsci/kft184.
• 原著論文7: Satonori Higuchi, Miki Nakajima, Tsuyoshi Yokoi et al.; Metabolic activation and inflammation reactions involved in carbamazepine-induced liver injury.; Toxicological Sciences , 130 (1) , 4-16 (2012); 10.1093/toxsci/kfs222.
• 原著論文8: Taishi Miyashita, Miki Nakajima, Tsuyoshi Yokoi et al.; Hepatoprotecitve effect of tamoxifen on steatosis and non-alcoholic steatohepatitis in mouse models. ; Journal of Toxicological Sciences , 37 (5) , 931-942 (2012)
• 原著論文9: Yukitaka Yoshikawa, Tatsuki Fukami, Tsuyoshi Yokoi et al; Mechanisms of the hepatoprotective effects of tamoxifen against drug-induced and chemical-induced acute liver injuries; Toxicology and Applied Pharmacology , 264 (1) , 42-50 (2012); 10.1016/j.taap.2012.06.023.
• 原著論文10: Shinya Endo, Miki Nakajima, Tsuyoshi Yokoi et al.; Stimulation of human monocytic THP-1 cells by metabolic activation of hepatotoxic drugs.; Drug Metabolism and Pharmacokinetics , 27 (6) , 621-630 (2012)
• 原著論文11: Azusa Yano, Miki Nakajima, Tsuyoshi Yokoi et al.; Involvement of immune-related factors in diclofenac-induced acute liver in mice; Toxicology , 293 (3) , 107-114 (2012); 10.1016/j.tox.2012.01.008.
• 原著論文12: Masanori Kobayashi, Miki Nakajima, Tsuyoshi Yokoi et al.; Th2 cytokines-mediated methimazole-induced liver injury in mice.; Journal of Applied Toxicology , 32 (10) , 823-833 (2012); 10.1002/jat.2731.
• 原著論文13: Yu Yamaura, Miki Nakajima, Tsuyoshi Yokoi et al.; Plasma microRNA profiles in rat models of hepatocellular injury, cholestasis, and steatosis. ; PLoS One , 7 (2) , e30250- (2012); 10.1371/journal.pone.0030250.
• 原著論文14: Yasuyuki Toyoda, Miki Nakajima, Tsuyoshi Yokoi et al.; Mechanism of exacebrative effect of progesterone on drug-induced liver injury.; Toxicological Sciences , 126 (1) , 16-27 (2012); 10.1093/toxsci/kfr326.
• 原著論文15: Satonori Higuchi, Miki Nakajima, Tsuyoshi Yokoi et al. ; Involvement of Th2 cytokines in the mouse model of flutamide-induced acute liver injury.; Journal of Applied Toxicology , 32 (10) , 815-822 (2012); 10.1002/jat.1706.
• 原著論文16: Hiroko Hosomi, Miki Nakajima, Tsuyoshi Yokoi et al.; Development of a higyly sensitive cytotoxicity assay system for CYP3A4-mediated metabolic activation. ; Drug Metabolism and Disposition , 39 (8) , 1388-1395 (2011); 10.1124/dmd.110.037077.
• 原著論文17: Yasuyuki Toyoda, Miki Nakajima, Tsuyoshi Yokoi et al.; Estradiol and progesterone modulate halothane-induced liver injury in mice.; Toxicology Letters , 204 (1) , 17-24 (2011); 10.1016/j.toxlet.2011.03.031
• 原著論文18: Satonori Higuchi, Miki Nakajima, Tsuyoshi Yokoi et al.; IL-4 mediated dicloxacillin-induced liver injury in mice.; Toxicology Letters , 200 (3) , 139-145 (2011); 10.1016/j.toxlet.2010.11.006.
• 原著論文19: Toshihisa Koga, Miki Nakajima, Tsuyoshi Yokoi et al.; Toxicological evaluation of acyl glucuronides of NSAIDs using HEK293 cells stably expressing human UGT and human hepatocytes.; Drug Metabolism and Disposition , 39 (1) , 54-60 (2011); 10.1124/dmd.110.035600.
• 原著論文20: Katsuhiko Mizuno, Miki Nakajima, Tsuyoshi Yokoi et al.; Stimulation of pro-inflammatory responses by mebendazole in human monocytic THP-1 cells through an ERK signaling pathway.; Archives Toxicology , 85 (3) , 199-207 (2011); 10.1007/s00204-010-0584-y.

公開日・更新日

• 公開日: 2015-05-26
• 更新日: 2017-06-13

収支報告書

• 文献番号: 201307007Z
• 報告年月日: 2014年05月17日

収入

• (1)補助金交付額: 39,000,000円
• (2)補助金確定額: 39,000,000円
• 差引額 [(1)-(2)]: 0円

支出

研究費 (内訳)	直接研究費	物品費	24,391,260円
		人件費・謝金	20,900円
		旅費	0円
		その他	5,587,840円
	間接経費		9,000,000円
	合計		39,000,000円

備考

• 備考: -

公開日・更新日

• 公開日: 2015-06-16
• 更新日: -