難治性骨折（偽関節）に対するヒト骨髄細胞シートを用いた低侵襲治療手技の開発に関する研究

文献情報

• 文献番号: 201306018A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: 難治性骨折（偽関節）に対するヒト骨髄細胞シートを用いた低侵襲治療手技の開発に関する研究
• 課題番号: H24-再生-若手-007
• 研究年度: 平成25(2013)年度
• 研究代表者(所属機関): 上羽 智之(公立大学法人 奈良県立医科大学 整形外科)

研究分担者(所属機関)

• 赤羽　学(公立大学法人　奈良県立医科大学　健康政策医学講座)
• 田中　康仁(公立大学法人　奈良県立医科大学　整形外科)
• 川手　健次(公立大学法人　奈良県立医科大学　人工関節・骨軟骨再生医学講座)
• 森田　有亮(同志社大学　生命医科学部　医工学科)
• 城戸　顕(公立大学法人　奈良県立医科大学　整形外科)
• 清水　隆昌(公立大学法人　奈良県立医科大学　整形外科)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 再生医療実用化研究
• 研究開始年度: 平成24(2012)年度
• 研究終了予定年度: 平成25(2013)年度
• 研究費: 4,165,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

本研究課題では、患者腸骨から採取した骨髄細胞から細胞シートの効率的な作製方法を検討し、その骨形成能の評価を免疫不全動物で行う。また大型動物であるヒツジでも細胞シートが作製可能か検証し、人工骨と組み合わせることにより、人工骨に骨形成能を付与することが出来るかを検討する。

研究方法

細胞シート作製条件の検討では、27歳女性の腸骨より骨髄細胞を採取し、T75フラスコで2週間初期培養後、35㎜培養皿にデキサメサゾン、アスコルビン酸添加培地で14日間培養した。播種する細胞数（1×104cell/cm2あるいは0.5×104cell/cm2）とデキサメサゾン濃度（10・30・50・100nM）をそれぞれの組み合わせで検討した。生体内での検討は細胞数を0.5×104cell/cm2とし、100mmディッシュを用いてデキサメサゾン濃度を10・30・50・100nMの4種類で細胞シートを作製した。細胞シートで人工骨を包み背部皮下に移植し、2か月で標本を摘出し、組織学的および生化学的に骨形成量を評価した。生化学的評価はALP・OC・BMP2・SP7・Runx2のmRNA発現をリアルタイムPCRで定量した。ヌードラット大腿骨偽関節モデルへの細胞シート移植では、偽関節部に直視下および注入で細胞シート移植をおこない、偽関節部の骨形成および骨癒合の検討をおこなった。経時的にレントゲン撮影し、12週で大腿骨を摘出し組織学的、力学的に骨癒合状態を評価した。細胞シート注入法の研究では7週齢ヌードラット背部皮下へあらかじめ人工骨を移植し、生体内の骨形成の検討を行った。移植した人工骨に10㎝培養皿で作製した細胞シートを注入移植した。　移植後1カ月で標本を摘出し組織学的に骨形成を評価した。また生化学的評価としてリアルタイムPCR法で骨形成マーカーのmRNA量を測定した。ヒツジ細胞による細胞シートの骨形成能評価は2歳オスヒツジの上腕骨頭より骨髄細胞を採取し、初期培養後、10㎝培養皿に細胞播種濃度：0.5×104cell/cm2デキサメタゾン濃度：50ｎM、アスコルビン酸濃度：82μg/mlで6日間培養し細胞シートを作製人工骨と組み合わせ、骨髄を採取したヒツジの背部皮下へ移植した。2週間後摘出し、生化学的および組織学的に評価をおこなった。

結果と考察

In vitroでのそれぞれの培養条件下でおこなったPCR法で測定されたALP・OC・BMP2・SP7・Runx2のmRNA量はデキサメタゾン濃度依存的に上昇が見られた。通常の骨分化誘導を行った群はシート群と同様の傾向が見られ、ほぼ同等量のmRNA発現が見られた。播種細胞密度によるmRNA発現量はほぼ同じ傾向であった。細胞外基質のwestern blottingでは、collagen1はデキサメタゾン濃度で差は認めなかったが、Lamininはデキサメタゾン50nMと100nMの比較では50nMの方が高かった。実際作製したシートはデキサメタゾン濃度が低い方が丈夫で裂けにくく、ハンドリングが容易であろうと推測できた。人工骨と細胞シートを組み合わせた組織像ではデキサメタゾン濃度が高い方が良好な骨形成が認められた。mRNA量は人工骨単独群より有意に高値であり、デキサメタゾン濃度が高いほうが高値であった。以上により培養条件は播種細胞密度：0.5×104cell/cm2、デキサメサゾン濃度：50ｎM、アスコルビン酸濃度：82μg/mlで14日間の２次培養が好ましいと考えられる。偽関節部への直視下および注入移植では骨性架橋は認められなかった。組織像でも偽関節部は骨性架橋を認めず、繊維性組織が介在していた。3点曲げ試験による力学試験では、細胞シート群と偽関節モデルでは、偽関節の最大曲げ荷重に差は認められなかった。注入移植後1か月目に摘出したβTCPの組織像では人工骨内に骨形成を認めた。摘出した標本のmRNA量はβ-TCP単独で移植した対照群と比べ、骨形成マーカーは統計学的に有意に高値であった。ヒツジへ移植後2週で摘出した人工骨内に骨形成を認めALP活性値の上昇が認められた。今回、大腿骨偽関節部に直視下・注入のいずれの移植方法でも偽関節部に骨癒合は得られなかった。細胞シートの骨形成能が偽関節部を癒合させるほどの骨形成能を有していない可能性や、免疫不全動物を使っているために、偽関節部での骨形成機構がうまく働いていない可能性もある。偽関節部を骨癒合させるには、細胞シートの枚数を増やして移植したり、骨形成能を高めるために新たに何らかの骨形成因子を加えたりする必要があると考える。

結論

ヒト骨髄細胞と大型動物の骨髄細胞から骨形成能を有する細胞シート作製できることが確認できた。偽関節部に対しては癒合が得られなかったことに関してはさらに工夫が必要であると考える。

公開日・更新日

• 公開日: 2015-03-03
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201306018B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: 難治性骨折（偽関節）に対するヒト骨髄細胞シートを用いた低侵襲治療手技の開発に関する研究
• 課題番号: H24-再生-若手-007
• 研究年度: 平成25(2013)年度
• 研究代表者(所属機関): 上羽 智之(公立大学法人 奈良県立医科大学 整形外科)

研究分担者(所属機関)

• 赤羽　学(公立大学法人　奈良県立医科大学　健康政策医学講座)
• 田中　康仁(公立大学法人　奈良県立医科大学　整形外科)
• 川手　健次(公立大学法人　奈良県立医科大学　人工関節・骨軟骨再生医学講座)
• 森田　有亮(同志社大学　生命医科学部　医工学科)
• 城戸　顕(公立大学法人　奈良県立医科大学　整形外科)
• 清水　隆昌(公立大学法人　奈良県立医科大学　整形外科)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 再生医療実用化研究
• 研究開始年度: 平成24(2012)年度
• 研究終了予定年度: 平成25(2013)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

偽関節部に我々が考案した細胞シートを注入移植し骨癒合を得られる低侵襲な手技を確立することである。ヒト細胞シートの効率的な作製方法を検討し、その骨形成能の評価を免疫不全動物でおこなう。ヌードラット大腿骨に偽関節を作製し、細胞シートを注入移植することで骨形成が得られるかを検討する。また大動物でも骨形成能を有する細胞シートが作製可能か追加実験をおこなった。

研究方法

市販された骨髄間葉系幹細胞を2週間初期培養した後、2次培養をおこない細胞シートを作製した。35mm培養皿に細胞播種数は1×104cell/cm2あるいは0.5×104cell/cm2、デキサメタゾン濃度は10nMあるいは100nMの組み合わせで細胞シート作製条件の検討をおこなった。作製した細胞シートを人工骨と組み合わせて、ヌードラットの背部皮下に移植し、生体内での骨形成能の検討を行った。移植後2カ月で標本を摘出し、組織学的および生化学的に骨形成量を評価した。また、7週齢ヌードラット背部皮下へあらかじめ人工骨を移植し、細胞シートを注入し、2カ月で標本を摘出し骨形成を評価した。患者腸骨より採取した骨髄細胞を2週間初期培養後、播種する細胞数とデキサメサゾン濃度を組み合わせて細胞シート作製条件の検討をおこなった。細胞シートと人工骨と組み合わせて、ヌードラットの背部皮下に移植し、生体内での骨形成能の検討をおこない組織学的および生化学的に骨形成量を評価した。ヌードラット大腿骨偽関節モデルへ偽関節部に直視下および注入で細胞シート移植をおこない、偽関節部の骨形成および骨癒合の検討をおこなった。経時的にレントゲン撮影し、12週で大腿骨を摘出し骨癒合状態を評価した。背部皮下の人工骨に細胞シート注入し移植後1カ月で標本を摘出し組織学的・生化学的に骨形成を評価した。ヒツジ細胞による細胞シートの骨形成能評価は2歳オスヒツジから骨髄細胞を採取し、初期培養後、10㎝培養皿に細胞播種濃度：0.5×104cell/cm2デキサメタゾン濃度：50ｎM、アスコルビン酸濃度：82μg/mlで6日間培養し細胞シートを作製し人工骨と組み合わせ、骨髄を採取したヒツジの背部皮下へ移植した。2週間後摘出し、生化学的および組織学的に評価をおこなった。

結果と考察

市販の細胞で作製した細胞シートではデキサメタゾン10nMのほうが100nMよりもOC分泌量が多い。播種細胞密度でのOCの差は見られなかった。In vivoでβ-TCPと細胞シートを組み合わせた組織像では、デキサメタゾンの濃度によらず、いずれも良好な骨形成が見られた。摘出したβ-TCPと細胞シートの組み合わせでは、β-TCP単独で移植したものより生化学的に高値であった。デキサメタゾン10nMで作製した細胞シートとの組み合わせのほうが100nMで作製した細胞シートとの組み合わせより高い値を示した。以上により培養条件は播種細胞密度：0.5×104cell/cm2、デキサメサゾン濃度：10nM、アスコルビン酸濃度：82μg/mlで21日間の２次培養が好ましいと考えられる。注入法でデキサメタゾンの濃度による骨形成の差を比較したが、いずれも良好な骨形成が確認できた。患者骨髄より作製した細胞シートは、骨形成マーカーのmRNA量はデキサメタゾン濃度依存的に上昇が見られた。播種細胞密度によるmRNA発現量はほぼ同じ傾向であった。細胞外基質のwestern blottingでは、collagen1はデキサメタゾン濃度で差は認めなかったが、Lamininはデキサメタゾン50nMの方が高かった。人工骨と細胞シートを組み合わせた組織像ではデキサメタゾン濃度が高い方が良好な骨形成が認められた。mRNA量は人工骨単独群より有意に高値であり、デキサメタゾン濃度が高いほうが高値であった。以上により培養条件は播種細胞密度：0.5×104cell/cm2、デキサメサゾン濃度：50ｎM、アスコルビン酸濃度：82μg/mlで14日間の２次培養が好ましいと考えられる。偽関節部への直視下および注入移植では骨性架橋は認められなかった。組織像でも偽関節部は骨性架橋を認めず、繊維性組織が介在していた。3点曲げ試験では、細胞シート群と偽関節モデルでは、偽関節の最大曲げ荷重に差は認められなかった。注入移植後1か月目に摘出したβTCPの組織像では人工骨内に骨形成を認めた。摘出した標本のmRNA量はβ-TCP単独で移植した対照群と比べ、骨形成マーカーは統計学的に有意に高値であった。ヒツジへ移植後2週で摘出した人工骨内に骨形成を認めALP活性値の上昇が認められた。

結論

ヒト骨髄細胞と大型動物の骨髄細胞から骨形成能を有する細胞シート作製できることが確認できた。偽関節部に対しては癒合が得られなかったことに関してはさらに工夫が必要であると考える。

公開日・更新日

• 公開日: 2015-03-03
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201306018C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: ヒト骨髄細胞から作製した細胞シートは骨形成マーカーの遺伝子発現がみられ、骨形成能を持つことが証明された。細胞シートの注入移植法でも、人工骨に骨形成が見られた。細胞シートの作製は容易であり、その取扱いも簡便である。本研究によって確立される治療法の潜在的な応用可能症例数は非常に多いと言え、汎用性がある点で今後の運動器再生医療の発展に寄与する学術的メリットも大きいと考える。
• 臨床的観点からの成果: 現在は臨床応用する前段階であるが、細胞シートを用いることで、難治性骨折（偽関節）治療に対して健常部から自家骨を採取する必要はなく、scaffold freeで注入をおこなうことが可能なためscaffoldによる弊害がなく低侵襲で実施でき、既存の治療法と併用できる。また、複雑な形状をした偽関節部へ容易にしかも確実に適合させることができる。
• ガイドライン等の開発: 今後の臨床応用に向けて、ガイドライン作成は必要と考える。
• その他行政的観点からの成果: 難治性骨折（偽関節症）の治療成績向上が期待できると同時に、他の運動器疾患治療への道も開ける。結果として、国民の健康増進に寄与し、今後の培養細胞を用いた再生医療に対する信頼性が高まるものと考える。
• その他のインパクト: 特になし。

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 0件
• その他論文(和文): 0件
• その他論文(英文等): 0件
• 学会発表(国内学会): 0件
• 学会発表(国際学会等): 0件
• その他成果(特許の出願): 0件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

公開日・更新日

• 公開日: 2015-05-26
• 更新日: 2018-06-05

収支報告書

• 文献番号: 201306018Z
• 報告年月日: 2014年08月18日

収入

• (1)補助金交付額: 4,165,000円
• (2)補助金確定額: 4,165,000円
• 差引額 [(1)-(2)]: 0円

支出

研究費 (内訳)	直接研究費	物品費	3,354,211円
		人件費・謝金	429,297円
		旅費	149,500円
		その他	231,992円
	間接経費		0円
	合計		4,165,000円

備考

• 備考: -

公開日・更新日

• 公開日: 2018-06-05
• 更新日: -