文献情報
文献番号
201237014A
報告書区分
総括
研究課題名
公衆浴場等におけるレジオネラ属菌対策を含めた総合的衛生管理手法に関する研究
課題番号
H22-健危-一般-014
研究年度
平成24(2012)年度
研究代表者(所属機関)
倉 文明(国立感染症研究所 細菌第一部)
研究分担者(所属機関)
- 森本 洋(北海道立衛生研究所 感染症センター微生物部)
- 八木田 健司(国立感染症研究所 寄生動物部)
- 山崎 利雄(国立感染症研究所 バイオセーフティ管理)
- 前川 純子(国立感染症研究所 細菌第一部 )
- 神野 透人(国立医薬品食品衛生研究所 生活衛生化学部)
- 佐原 啓二(静岡県環境衛生科学研究所 微生物部)
- 中嶋 洋(岡山県環境保健センター 保健科学部)
- 大屋 日登美(神奈川県衛生研究所 微生物部)
- 烏谷 竜哉(愛媛県立衛生環境研究所 衛生研究課)
- 緒方 喜久代(大分県衛生環境研究センター 微生物担当)
- 荒井 桂子(横浜市衛生研究所 検査研究課)
- 磯部 順子(富山県衛生研究所 細菌部)
- 縣 邦雄(アクアス株式会社つくば総合研究所)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究 健康安全・危機管理対策総合研究
研究開始年度
平成22(2010)年度
研究終了予定年度
平成24(2012)年度
研究費
16,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
重篤な肺炎を引き起こすレジオネラによる、浴槽水等の水環境の汚染が問題となっている。培養検査に1週間を要し、迅速検査法が求められている。培養検査法の測定値は信頼性が懸念され、外部精度管理が必要とされている。遊離塩素消毒しても安全性の確保困難な浴槽水があり、解決に向けモノクロラミン消毒の効果を実際の浴槽施設において検証する。
研究方法
保健所等に周知し施設利用者に告知を行ない、浴槽水にモノクロラミンを自動的に生成・測定した。短時間の液体培養後にrRNAを定量的に検出するLC (Liquid culture) qRT-PCR法、及び死菌のDNAの増幅を抑制するethidium monoazideを用いたEMA-qPCR法を応用して菌数を測定した。Legionella pneumophila（Lp）株の塩基配列決定（SBT法）による分子疫学を行った。研究所の管理規定に従い、個人情報保護と病原体管理に注意した。
結果と考察
1）pH7.8～9.0の循環式温泉入浴施設3ヶ所で、モノクロラミン濃度を3mg/L程度に維持管理し、浴槽水、ろ過器内水のレジオネラ属菌を不検出に維持出来た。従属栄養細菌、アメーバも不検出であった。塩素臭の主因となるトリクロラミンは検出されなかった。モノクロラミン消毒は遊離塩素消毒に比べ、消毒副生成物が低減した。ヨウ素イオンを含む温泉水では、遊離塩素消毒の場合と同様にヨウ素化消毒副生成物を生じた。
2）入浴施設調査で、レジオネラ菌数を迅速かつ高感度に評価可能なLC RT-qPCRを改良した。LCとEMAの組み合わせ応用によるLC EMA-qPCR法レジオネラ生菌迅速検査法を市販化した。いずれの方法も、従来の培養1週間を要することなく、短期間で平板培養法の結果を予測可能であった。
3）BCYEα液体培地（活性炭を除く）に生菌を添加した標準試料を作製し、外部精度管理を試行した。試料にはゼラチンを添加し、輸送時の衝撃を低減させた。自家製平板培地に比べ市販培地では検出菌数が低下し、検査者による変動も認められた。寒天培地への菌の塗布はソフトタッチで行うと検出率が高まった。将来の外部精度管理の事業化が期待された。
4）アメーバで増殖したLpのろ過法による回収率は、ポリカーボネート、セルロースアセテート、セルロース混合エステルの中で、0.2μmポリカーボネートが最もよかった。ポリカーボネート0.4 μm、セルロースアセテート0.45 μmのフィルターでは少量のレジオネラが通過したが、混合エステル0.45 μmでは通過しなかった。フィルターとハイドロキシアパタイトの組合せのろ過法も検討した。
5）2011年度に収集された臨床分離株は45株（38人の患者から分離したLp、溺水事例では複数株が分離）で、32種類の遺伝子型に分けられ、そのうち新規遺伝子型は13種類であった。Minimum spanning tree解析を行うと、環境分離株は生息環境に対応してグループ(浴槽3、冷却塔2、土壌3)に分かれた。
6）水溜り65検体と車のウオッシャー液106検体についてレジオネラ属菌の調査を実施した。水溜り、ウオッシャー液の各々32.3％、2.8％からレジオネラ属菌が分離された。水溜りから分離されたレジオネラ属菌ではLp 血清群1が26.3％ともっとも多く、患者から分離される頻度の高いlag-1を保有する株はそのうち50.0％であった。
7）岡山県内のレジオネラ症散発患者から近年分離されたLp 血清群3（ST93）7株はパルスフィールドゲル電気泳動法で同じバンドパターンを示し、同一感染源と予想された。多数の環境分離株を調査したが同じパターンは得られず、感染源は未だ不明であり、さらなる調査が必要である。
8）公衆浴場等から検出される抗酸菌の再調査をおこなった。482検体の内抗酸菌陽性は60検体で、検出された抗酸菌は15菌種75株であった。この内Mycobacterium avium 19株と研究室保存のM. avium 計89株を用いて縦列反復数可変領域型別をおこなった。Minimum spanning tree法による解析では、得られた遺伝子型は3つのグループに大別された。
9）宮崎県、郡山市のレジオネラ症防止のための講習会に対応した。厚労省の生活衛生関係技術担当者研修会において成果を解説した。大分県環境監視員を対象に2回研修を行った。感染研のホームページの感染症の話でレジオネラ症を改訂した。
2）入浴施設調査で、レジオネラ菌数を迅速かつ高感度に評価可能なLC RT-qPCRを改良した。LCとEMAの組み合わせ応用によるLC EMA-qPCR法レジオネラ生菌迅速検査法を市販化した。いずれの方法も、従来の培養1週間を要することなく、短期間で平板培養法の結果を予測可能であった。
3）BCYEα液体培地（活性炭を除く）に生菌を添加した標準試料を作製し、外部精度管理を試行した。試料にはゼラチンを添加し、輸送時の衝撃を低減させた。自家製平板培地に比べ市販培地では検出菌数が低下し、検査者による変動も認められた。寒天培地への菌の塗布はソフトタッチで行うと検出率が高まった。将来の外部精度管理の事業化が期待された。
4）アメーバで増殖したLpのろ過法による回収率は、ポリカーボネート、セルロースアセテート、セルロース混合エステルの中で、0.2μmポリカーボネートが最もよかった。ポリカーボネート0.4 μm、セルロースアセテート0.45 μmのフィルターでは少量のレジオネラが通過したが、混合エステル0.45 μmでは通過しなかった。フィルターとハイドロキシアパタイトの組合せのろ過法も検討した。
5）2011年度に収集された臨床分離株は45株（38人の患者から分離したLp、溺水事例では複数株が分離）で、32種類の遺伝子型に分けられ、そのうち新規遺伝子型は13種類であった。Minimum spanning tree解析を行うと、環境分離株は生息環境に対応してグループ(浴槽3、冷却塔2、土壌3)に分かれた。
6）水溜り65検体と車のウオッシャー液106検体についてレジオネラ属菌の調査を実施した。水溜り、ウオッシャー液の各々32.3％、2.8％からレジオネラ属菌が分離された。水溜りから分離されたレジオネラ属菌ではLp 血清群1が26.3％ともっとも多く、患者から分離される頻度の高いlag-1を保有する株はそのうち50.0％であった。
7）岡山県内のレジオネラ症散発患者から近年分離されたLp 血清群3（ST93）7株はパルスフィールドゲル電気泳動法で同じバンドパターンを示し、同一感染源と予想された。多数の環境分離株を調査したが同じパターンは得られず、感染源は未だ不明であり、さらなる調査が必要である。
8）公衆浴場等から検出される抗酸菌の再調査をおこなった。482検体の内抗酸菌陽性は60検体で、検出された抗酸菌は15菌種75株であった。この内Mycobacterium avium 19株と研究室保存のM. avium 計89株を用いて縦列反復数可変領域型別をおこなった。Minimum spanning tree法による解析では、得られた遺伝子型は3つのグループに大別された。
9）宮崎県、郡山市のレジオネラ症防止のための講習会に対応した。厚労省の生活衛生関係技術担当者研修会において成果を解説した。大分県環境監視員を対象に2回研修を行った。感染研のホームページの感染症の話でレジオネラ症を改訂した。
結論
モノクロラミン消毒を入浴施設に導入し実用化した。レジオネラ生菌を検出する迅速検査をキット化した。培養法の外部精度管理を実施し問題点を明らかにした。感染源不明事例の菌の遺伝子型から潜在的感染源としての水溜まりを明示した。
公開日・更新日
公開日
2013-04-25
更新日
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