デルマタン4-O-硫酸基転移酵素-1欠損に基づくエーラスダンロス症候群の病態解明と治療法の開発

文献情報

文献番号

201231174A

報告書区分

総括

研究課題名

デルマタン4-O-硫酸基転移酵素-1欠損に基づくエーラスダンロス症候群の病態解明と治療法の開発

課題番号

H24-難治等（難）-一般-073

研究年度

平成24(2012)年度

研究代表者(所属機関)

古庄　知己(国立大学法人　信州大学　医学部付属病院遺伝子診療部)

研究分担者(所属機関)

小林　身哉(金城学院大学　生活環境学部　食環境栄養学科)
菅原　一幸(北海道大学大学院先端生命科学研究院　生命機能科学研究部門　プロテオグリカン医療応用研究室)
福嶋　義光(国立大学法人　信州大学　医学部遺伝医学・予防医学講座)
籏持　淳(獨協医科大学　皮膚科)
武田　伸一(独立行政法人国立精神・神経医療研究センター　神経研究所　遺伝子疾患治療研究部)
佐々木克典(国立大学法人　信州大学　医学部組織発生学講座)
中山　淳(国立大学法人　信州大学　大学院医学系研究科分子病理学)
松本　直通(横浜市立大学　大学院医学研究科　遺伝学)
野村　義宏(東京農工大学　農学部硬蛋白質利用研究施設)
岡田　尚巳(独立行政法人国立精神・神経医療研究センター　神経研究所　遺伝子疾患治療研究部)
三宅　紀子(横浜市立大学　大学院医学研究科　遺伝学)
岳　鳳鳴(国立大学法人　信州大学　医学部組織発生学講座)
水本　秀二(北海道大学大学院先端生命科学研究院　生命機能科学研究部門　プロテオグリカン医療応用研究室)

研究区分

厚生労働科学研究費補助金疾病・障害対策研究分野難治性疾患等克服研究（難治性疾患克服研究）

研究開始年度

平成24(2012)年度

研究終了予定年度

平成25(2013)年度

研究費

6,500,000円

研究者交替、所属機関変更

-

研究報告書（概要版）

研究目的

エーラスダンロス症候群（EDS）は、皮膚・関節の過伸展性、各種組織の脆弱性を特徴とする先天性疾患の総称である。我々は、平成21-23年度難治性疾患克服研究事業の支援を受け、進行性結合組織脆弱性（皮膚過伸展・脆弱性、全身関節弛緩・脱臼・変形、巨大皮下血腫）、発生異常（顔貌の特徴、先天性多発関節拘縮）に特徴付けられるEDSの新病型（EDS, Kosho type）を発見、その病態が「CHST14遺伝子変異→デルマタン4-O-硫酸基転移酵素-1（D4ST1）欠損→デコリン（DCN）に付加するグリコサミノグリカン（GAG）鎖の組成変化（正常ではデルマタン硫酸[DS]であるが、患者ではコンドロイチン硫酸[CS]に置換）→DCNを介するコラーゲン細線維のassembly不全」であることを示し、疾患概念を確立した。さらにD4ST1-deficient EDS（DDEDS）と命名するとともに診療指針を提案した。平成24-25年度、遺伝子治療の専門施設を含めた包括的な共同研究体制を構築し、新規患者の収集、自然歴調査を継続し、診療指針をアップデートすることに加えて、疾患モデルを用いた病態解析、および、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを用いた遺伝子治療の開発を目指す。

研究方法

DDEDS疑い患者およびその検体（末梢血由来DNA、培養皮膚線維芽細胞、病理検体）を収集した。CHST14遺伝子解析を行い、確定診断例を抽出した後、自然歴情報を収集・分析した。患者由来培養皮膚線維芽細胞、尿等を用いた糖鎖解析（酵素活性測定、CS/DS組成分析）および皮膚、筋肉、骨等の患者組織を用いた病理解析（DCNの免疫組織学的検討、GAG鎖を特異的に染色するcupromeronic blue[CB]染色法を用いた電顕観察等）を行った。患者由来iPS細胞を用いて、多能性、未分化状態、分子遺伝学的・生化学異常の再現性を検討した。相同組み換えにより作製したノックアウトマウス由来精子を入手、受精卵を作製し、ヘテロマウス、さらに、ノックアウトマウス作出を試みた。AAVベクターによる遺伝子治療研究の前段階として、ヒトD4ST1およびマウスD4st-1発現AAVベクタープラスミドの構築を行った。

結果と考察

現在までに本研究班では18家系19患者の発見を見出し、報告例と合わせ国内17家系19例、海外11家系19例となった。糖鎖解析では罹患者の酵素活性は欠損しており、尿中DSは全く検出されなかった。内反足を認めなかった軽症患者においてわずかにDSが検出され、DSの合成状態と臨床症状の関連が注目された。抗DCN抗体を用いた免疫組織化学検討では、コントロールではコラーゲン線維束に不均一ながらべったりと抗DCN抗体により染色されたが、患者ではコラーゲン線維束に沿いfilamentousに染色された。CB染色を用いた電顕観察により、患者の真皮のコラーゲン細線維を束ねるDCNのGAG鎖を観察することに成功した。患者由来iPS細胞の未分化能および多能性は、健常人由来iPS細胞と同等であった。患者iPS細胞をSKIDマウスに移植することにより生じた奇形種では、患者皮膚組織と同様の抗DCN抗体染色異常を呈しており、DDEDSの病態の本質を再現していると考えられた。患者由来iPS細胞の方が、神経系への分化誘導効率が低く、患者の神経病態との関係が注目された。ノックアウトマウスの作出に成功し、その尿中にはDSが検出されなかったことから、生化学的異常を再現していると考えられた。本マウスは、野生型マウスと比べて、身体発育の低下が認められている。正確な病態評価には、純粋なC57BL/6J系統を遺伝的背景に持つノックアウトマウスが不可欠であり、スピードコンジェニック法により作出を試みている。D4st-1を組み込んだプラスミドを構築し、D4st-1の発現を確認した。

結論

DDEDSは、比較的頻度の高い重要なEDS病型である。尿中DS測定と皮膚組織を用いた抗DCN染色は診断的価値のある特異的分析である。疾患モデルとしてiPS細胞、ノックアウトマウスを確立した。iPS細胞は病態を再現しており、今後様々な細胞へ分化させ機能解析を展開、病態解明に役立てる。ノックアウトマウスの詳細な表現型解析（症状、自然歴、病理および生理学的所見）を行い、DDEDS患者の特徴を再現しているかを検討する。AAVベクターの改良を重ねながら、患者由来皮膚線維芽細胞およびiPS細胞、ノックアウトマウス由来線維芽細胞、およびノックアウトマウスを用いて、D4ST1またはD4st-1が補充され、機能が回復するかを検討する。