肝炎ウイルスによる肝疾患発症の宿主要因と発症予防に関する研究

文献情報

• 文献番号: 201227008A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: 肝炎ウイルスによる肝疾患発症の宿主要因と発症予防に関する研究
• 課題番号: H22-肝炎-一般-008
• 研究年度: 平成24(2012)年度
• 研究代表者(所属機関): 下遠野 邦忠(千葉工業大学 附属総合研究所)

研究分担者(所属機関)

• 高久　洋(千葉工業大学　工学部)
• 堀田　博(神戸大学大学院　医学研究科)
• 加藤　宣之(岡山大学医歯薬学総合研究科)
• 小原　恭子(鹿児島大学　農学部)
• 杉山　和夫(慶応義塾大学医学部)
• 村上　善基(大阪市立大学　医学部)
• 丸澤　宏之(京都大学大学院医学研究科)
• 大島　隆幸(徳島文理大学香川薬学部)
• 有海　康雄(熊本大学エイズ学研究センター)
• 押海　裕之(北海道大学大学院医学研究科)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 肝炎等克服緊急対策研究
• 研究開始年度: 平成22(2010)年度
• 研究終了予定年度: 平成24(2012)年度
• 研究費: 41,454,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

本研究では、HCV複製を阻止する方策を見出すとともにウイルス感染予防、肝疾患進展の予防法の確立を目指して以下の研究をおこなう。1. HCV排除を目的として複製、増殖を制御する宿主因子を探索しその機能を解明する。2. HCV感染により変化が知られている宿主機能を制御する要因の解析をおこなう。3.　HCV感染が宿主要因を変化させる分子基盤を解明する。4.ウイルスタンパク質による細胞の機能変化及び感染による宿主の機能変化を調べる。5. HCV2型以外の複製系を開発して抗ウイルス剤開発に役立てる。

研究方法

HCV感染あるいは複製が宿主に及ぼす効果の解析には、HCVゲノムを導入したレプリコン細胞あるいは、HCVが感染増殖する系を用いた。ウイルス蛋白質の機能解析には、各ウイルス蛋白質を導入した細胞の増殖変化、代謝変化などを生化学的手法により解析した。蛋白質、mRNA等の解析はウエスタンブロット、塩基配列決定、定量PCR等常法に従った。蛋白質の会合に免疫沈降反応を行い、さらにゲル電気泳動とウエスタンブロットを行った。蛋白質の細胞内局在の解析には間接蛍光抗体法を用いた。酵母Two-hybrid法による蛋白質会合の解析も行った。DNAメチル化解析はIlluminaのメチル化プローブを用いた。HCVレプリコン細胞を、３年間培養しmRNAの量的変化をマイクロアレイにて解析した。肝炎あるいは肝がん患者生検組織からRNAを抽出してその中のHCV RNAを次世代塩基配列解析機で解析した。HCV感染あるいはHCV RNA等で刺激した細胞あるいはマウス個体の自然免疫変化をコントロールと対比して解析した。

結果と考察

本年度の成果は以下の内容に要約できる。
1.HCV感染増殖を制御する宿主因子の探索とその機能解析：HCV RNAの翻訳にはHsp90/eIF3c/HCV IRES複合体の形成が生じることが必須であることを明らかにした。2.HCV感染による宿主側の変化：HCVがFoxO1のリン酸化を抑制する結果、糖新生の律速酵素であるホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（PEPCK）及びグルコース-6-ホスファターゼ（G6Pase）の発現を促進させることを明らかにした。また、HCVの持続発現に伴い発現誘導されたDHCR24がHCVの増殖、p53活性を抑制する事を明らかにした。Coreタンパク質がEwing肉腫の原因因子であるEWSと会合する事を見いだた。3.HCV感染が宿主に及ぼす遺伝的な変化：HCVゲノムが持続的に複製している細胞では発現亢進する遺伝子に加え、減少する遺伝子が存在した。これらの変化の原因としてDNAメチル化が考えられた。発現が亢進した遺伝子の中には肝線維化や肥満に関するものが存在した。C型慢性肝炎でヒト遺伝子編集酵素が誘導されることを見出した。HCVゲノム配列に編集酵素が塩基変化を誘導した。HCV感染細胞においてメチル化が亢進する遺伝子と減少する遺伝子が多数検出され、エピジェネティック変化を介した宿主の情報伝達変化が存在することを強く示唆した。4.HCVと自然免疫：III型インターフェロンは、生体内ではIPS-1分子を介して産生されること、またこのときCD8陽性の樹状細胞が重要であることを見いだした。また、HCVのNS3-4AプロテーアーゼがIPS-1分子の上流で働くRiplet分子を分解し、自然免疫から逃避する可能性を示した。HCV増殖複製系の開発：HCV1b型の感染複製系を樹立するための開発研究を行った。
３年計画の最終年度にあたり、これまでの研究成果をさらに進展させると同時に、HCV感染によるエピジェネティック変化などの解析も行った。ウイルスの感染阻止の研究から疾患発症の機構解明とそれをもとにした疾患予防に至るまで研究の範囲は多岐に亘った。

結論

３年目の最終年度である事からこれまでの研究をさらに押し進めること、および新たな視点からの研究を展開した。得られた成果は上に記載の通りであるが、その中でも新たな成果としてHCV感染によるDNAメチル化の変化が注目される。感染によるエピジェネティック変化をコントロールできれば、疾患発症の予防に役立つ可能性がある。また、本年度得られた成果の中から、治療あるいは予防法に役立つものがあるので、その成果をさらに深めていくこと事が重要である。培養細胞と臨床材料を用いた解析に加えて、疾患の発症解析には動物モデル系が重要である。今後モデル系の開発にも取り組み個体レベルでの疾患解析にも取り組む必要がある。

公開日・更新日

• 公開日: 2015-06-03
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201227008B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: 肝炎ウイルスによる肝疾患発症の宿主要因と発症予防に関する研究
• 課題番号: H22-肝炎-一般-008
• 研究年度: 平成24(2012)年度
• 研究代表者(所属機関): 下遠野 邦忠(千葉工業大学 附属総合研究所)

研究分担者(所属機関)

• 高久　洋(千葉工業大学工学部)
• 堀田　博(神戸大学大学院医学系研究科)
• 加藤　宣之(岡山大学大学院医歯薬学総合研究科)
• 小原　恭子(鹿児島大学共同獣医学部)
• 杉山　和夫(慶応義塾大学医学部)
• 村上　善基(大阪市立大学大学院医学研究科)
• 丸澤　宏之(京都大学大学院医学研究科)
• 大島　隆幸(徳島文理大学香川薬学部)
• 有海　康雄(熊本大学エイズ学研究センター)
• 押海　裕之(北海道大学大学院医学研究科)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 肝炎等克服緊急対策研究
• 研究開始年度: 平成22(2010)年度
• 研究終了予定年度: 平成24(2012)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

C型肝炎ウイルス感染は高率に慢性肝炎を発症し、その中から肝硬変や肝がんに高い割合で進行する。慢性C型肝炎に対する現行の治療はインターフェロンを中心に進み、現在ではウイルス蛋白質の機能を標的にした治療薬が上市されている。しかし、副作用の点を考えるとより安全な治療法の開発が切望されるが、それには、ウイルスの持続感染・増殖を支える宿主要因を明らかにし、その知見をもとにした抗ウイルス剤の開発が望まれる。慢性肝炎から肝疾患が進む過程で持続炎症による宿主側の機能変化がどのように変化して行くのか、また、増悪化がどのような機構で進むのか、などの理解が乏しいために、本研究では、肝疾患の原因となるHCVを制御する事により疾患予防に寄与する方法を見いだす事、および疾患発症の分子機構を明らかにして、発症を予防する事などを主たる目的とした研究を進める。得られる知見を疾患発症の予防・治療に役立てる。

研究方法

HCV感染あるいは複製が宿主に及ぼす効果を解析するためにレプリコン細胞あるいは、HCVが感染増殖する系を用いた。各ウイルス蛋白質を導入した細胞の増殖変化、代謝変化などは生化学的手法により解析した。蛋白質、mRNA等の解析は常法に従った。蛋白質の会合には、免疫沈降反応、ウエスタンブロット法で行った。蛋白質の細胞内局在は間接蛍光抗体法で行った。DNAメチル化解析にはIlluminaのメチル化プローブを用いた。HCVレプリコン細胞を３年間培養し、mRNAの量的変化をマイクロアレイにて解析した。肝炎あるいは肝がん由来の生検組織中のHCV RNAを次世代塩基配列解析機で解析した。HCVで刺激した細胞あるいはマウス個体の自然免疫変化をコントロールと対比して解析した。

結果と考察

C型炎ウイルス感染による慢性肝炎、肝硬変、肝がんの発症機構を理解し、予防および治療に役立てる方策を見いだすべく平成２２年から２４年の３年間研究を推進した。得られた研究成果は以下の通りである。（１）HCV増殖を制御する因子とその機能解析；(i) HCVの翻訳反応にHsp90が重要な働きをしている事を見いだし、Hsp90阻害剤によりウイルス増殖が抑制された。(ii) HCV感染により細胞内のmRNAの働きを制御する環境が変化した。（２）HCV感染と代謝変化に関して；（i）アポリポ蛋白質（Apo-E）はウイルス粒子に会合して、感染に重要な働きをした。Apo-Eのアイソフォームの違いにより、ウイルス感染性は大きく影響を受けた。(ii) HCV感染にはLDLR, SR-BIの両受容体が細胞膜表面に発現することが必要である可能性が考えられた。(iii) HCV感染による糖新生亢進の機構を明らかにした。（３）HCV持続感染により恒常的に発現増加あるいは発現抑制される遺伝子をみいだした。その中に肝繊維化に働くものも存在した。持続感染細胞において産生増加するコレステロール合成に関わる酵素DHCR24はp53にも働き細胞周期を変化させる作用を示した。（４）HCV感染は自然免疫に係るRIGIを活性化するRipletを分解することを見いだした。（５）C型慢性肝炎治療にmiRNAの変化を指標にできる可能性を見いだした。（６）ウイルス感染により遺伝子編集酵素が誘導発現され、それがウイルスゲノムに変化を与える要因のひとつになると考えられた。（７）感染細胞内ではエピジェネティック変化による遺伝情報制御が存在した。得られた情報は多岐に亘るが、その中にはすぐに抗ウイルス因子の探索に役立つもの、感染や疾患予防に向けた挑戦に新たな視点を与えるものもある。

結論

C型炎ウイルス感染による慢性肝炎、肝硬変、肝がんの発症機構を理解し、予防および治療に役立てる方策を見いだすべく、平成２２年から２４年の３年間研究を推進した。限られた時間と限られた人材でこれらの疾患の発症機構を網羅することは困難であるために、本研究班が成立する前の研究進展状況をさらに発展させる事を主な目的とするとともに、新たな研究展開が期待できる若手研究者の参画を心がけた。得られた情報は多岐に亘るが、その中にはすぐに抗ウイルス因子の探索に役立つものに加えて、感染や疾患予防に向けた挑戦に新たな視点を与えるものもある。疾患モデル系の開発が研究の進展に有効である事を認識した。

公開日・更新日

• 公開日: 2015-06-03
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201227008C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: C型肝炎ウイルス（HCV）感染による細胞の種々の変化を分子レベルで明らかにして、疾患予防に結びつく研究を目指した。HCV感染による脂質代謝変化とウイルス増殖との関係、および糖新生の亢進の分子機構等を明らかにした。また、持続感染細胞の遺伝子発現変化を解析し、ウイルスによる直接の制御以外にエピジェネティック制御も関与する事を明らかにした。感染者体内のウイルス遺伝子の高変異の原因として、ウイルスによる遺伝子編集酵素活性の誘導が考えられた。
• 臨床的観点からの成果: HCV感染者におけるウイルスゲノム配列の高変異性が遺伝子編集酵素活性の誘導による可能性を明らかにした。ゲノム配列の中には抗HCV剤に対して抵抗性を示すのが治療前に既に見いだされる場合もあるので、治療開始前に遺伝子配列情報を得る事が治療後の成績に役立つと考えられる。また、miRNAの発現が治療成績の予測に役立つと考えられる成果を得た。
• ガイドライン等の開発: 特になし。
• その他行政的観点からの成果: 特になし。
• その他のインパクト: 特になし。

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 140件
• その他論文(和文): 0件
• その他論文(英文等): 0件
• 学会発表(国内学会): 45件
• 学会発表(国際学会等): 26件
• その他成果(特許の出願): 9件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

特許

• 特許の名称: p53 癌抑制蛋白との結合に関与するC 型肝炎ウイルス非構造蛋白NS3 のアミノ酸残基の同定と、医薬開発への利用
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 特許4565180 ; 発明者名: 堀田 博 ; 出願年月日: 20100813 ; 国内外の別: 国内

• 特許の名称: C型肝炎ウイルス株の評価方法及びその利用
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 特願2010-206800 ; 発明者名: 堀田 博 ; 出願年月日: 20100915 ; 国内外の別: 国内

• 特許の名称: C型肝炎ウイルス阻害剤
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 出願番号12/241868 ; 発明者名: 小原恭子、小原道法 他 ; 権利者名: 化学及血清療法研究所、財団法人東京都医学研究機構、国立大学法人熊本大学 ; 国内外の別: 国外

• 特許の名称: テスト体液サンプルの分離方法
• 詳細情報: 分類: ; 特許番号: 特願2012-37586 ; 発明者名: 村上善基 ; 出願年月日: 20120907 ; 国内外の別: 国内

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Kuroki M, Ariumi Y, Kato N., et al.; PML tumor suppressor protein is required for HCV production.; Biochem. Biophys. Res. Commun. , 430 , 592-597 (2013)
• 原著論文2: Salem NE, Saito M, Tsukiyama-Kohara K et al.; Genomic polymorphisms in 3β-hydroxysterol Δ24-reductase promoter sequences.; Microbiol Immunol. , 57 , 179-184 (2013)
• 原著論文3: Toyoda H, Kumada T, Murakami Y et al.; Higher Hepatic Gene Expression and Serum Levels of Matrix Metalloproteinase-2 are Associated with Steatohepatitis in Non-alcoholic Fatty Liver Diseases.; Biomarkers , 18 , 82-87 (2013)
• 原著論文4: Takeda M, Ikeda M, Kato N. et al.; Development of hepatitis C virus production reporter-assay systems using two different hepatoma cell lines; J. Gen. Virol. , 93 , 1422-1431 (2012)
• 原著論文5: Matsui C, Shoji I, Hotta H et al.; Hepatitis C virus infection suppresses GLUT2 gene expression via down-regulation of hepatocyte nuclear factor 1α; J Virol. , 86 (23) , 12903-12911 (2012)
• 原著論文6: Kim SR, El-Shamy A, HOtta H., et al.; Prediction of response to pegylated interferon/ribavirin combination therapy for chronic hepatitis C genotype 1b and high viral load.; J Gastroenterol. , 47 (10) , 1143-1151 (2012)
• 原著論文7: Weng L, Tian X, Shimotohno K. et al.; Different mechanisms of hepatitis C virus RNA polymerase activation by cyclophilin A and B in vitro.; Biochim Biophys Acta. , 1820 (12) , 1886-1892 (2012)
• 原著論文8: Sejima H, Mori K, Kato N; Identification of host genes showing differential expression profiles with cell-based long-term replication of hepatitis C virus RNA.; Virus Res. , 167 , 74-84 (2012)
• 原著論文9: Kasama Y, Saito M, Tsukiyama-Kohara K. et al., ; Translocase of outer mitochondrial membrane 70 induces interferon response and is impaired by hepatitis C virus NS3.; Virus Research , 163 , 405-409 (2012)
• 原著論文10: Okuyama S, Marusawa H, Marusawa H. et al.,; Excessive activity of apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic polypeptide 2 (APOBEC2) contributes to liver and lung tumorigenesis.; Int J Cancer. , 130 , 1294-1301 (2012)
• 原著論文11: Tomita K, Teratani T, Sugiyama K. et al.,; p53/p66Shc-mediated signaling contributes to the progression of non-alcoholic steatohepatitis in humans and mice.; J Hepatolo. , 57 , 837-843 (2012)
• 原著論文12: Shime H, Matsumoto M, Oshiumi H, et al., ; Toll-like receptor 3 signaling converts tumor-supporting myeloid cells to tumoricidal effectors.; Proc Natl Acad Sci U S A, , 109 , 2066-2071 (2012)
• 原著論文13: Ueda Y, Marusawa H, Kaido T, et al.,; Efficacy and safety of prophylaxis with entecavir and hepatitis B immunoglobulin in preventing hepatitis B recurrence after living donor liver transplantation.; Hepatol Res. , 43 , 67-71 (2012)
• 原著論文14: Mori K, Ueda Y, Ariumi Y, et al., ; Development of a drug assay system with hepatitis C virus genome derived from a patient with acute hepatitis C.; Virus Genes , 44 , 374-383 (2012)
• 原著論文15: Kim SR, El-Shamy A, HOtta H et al.,; Prediction of response to pegylated interferon/ribavirin combination therapy for chronic hepatitis C genotype 1b and high viral load.; J Gastroenterol. , 47 (10) , 1143-1151 (2012)
• 原著論文16: Ariumi Y, Kuroki M, Kato N. et al., ; Hepatitis C virus hijacks P-body and stress granule components around lipid droplets.; J Virol. , 85 (14) , 6882-6892 (2011)
• 原著論文17: Oshiumi H, Matsumoto M, Seya T. ; Ubiquitin-mediated modulation of the cytoplasmic viral RNA sensor RIG-I.; J. Biochemistry , 151 , 5-11 (2012)
• 原著論文18: Hishiki T, Shimizu Y, shimotohno K et al.,; Infectivity of hepatitis C virus is influenced by association with apolipoprotein E isoforms.; J Virol. , 84 (22) , 12048-12057 (2011)
• 原著論文19: Ujino S, Yamaguchi S. Takaku H et al.,; Combination therapy for hepatitis C virus with heat-shock protein 90 inhibitor 17-AAG and proteasome inhibitor MG132.; Antivir Chem Chemother. , 20 , 161-167 (2010)
• 原著論文20: 120. Mori K, Ikeda M, Kato N et al., ; Gene expression profile of Li23, a new human hepatoma cell line that enables robust hepatitis C virus replication: Comparison with HuH-7 and other hepatic cell lines.; Hepatol. Res. , 40 , 1248-1253 (2010)

公開日・更新日

• 公開日: 2015-06-03
• 更新日: 2018-03-20

収支報告書

• 文献番号: 201227008Z