食肉食鳥衛生検査における家禽・家畜等のウイルス性疾病検査に関する研究

文献情報

• 文献番号: 201033013A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: 食肉食鳥衛生検査における家禽・家畜等のウイルス性疾病検査に関する研究
• 課題番号: H20-食品・一般-014
• 研究年度: 平成22(2010)年度
• 研究代表者(所属機関): 棚林 清(国立感染症研究所 獣医科学部)

研究分担者(所属機関)

• 岡崎　克則(北海道医療大学　薬学部)
• 池田　秀利(日本獣医生命科学大学　獣医学部)
• 伊藤　壽啓(鳥取大学　農学部)
• 杉山　誠(岐阜大学　応用生物科学部)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 食品の安心・安全確保推進研究
• 研究開始年度: 平成20(2008)年度
• 研究終了予定年度: 平成22(2010)年度
• 研究費: 12,825,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

食肉・食鳥衛生検査所で実施可能なウイルス学的検査方法の開発・改良・検証や家畜におけるウイルス感染の実態調査を目的とした。

研究方法

多種類のウイルス検査に応用可能な（RT-）PCR法のマニュアルを策定し、豚検体で10種類のウイルスを調査した。牛白血病ウイルス検査PCR法の簡略化と標準化を試みた。また、検出されたウイルスゲノムの系統進化解析を行った。高病原性鳥インフルエンザと鑑別が必要なニューカッスル病の迅速検査RT-LAMP法の検証を行った。網羅的病原体検出マイクロアレイのプローブを用いて安価で汎用的なマイクロプレートハイブリダイゼーション(MPH)法を試みた。家畜におけるA群ロタウイルスの調査と簡便なロタウイルスの全分節遺伝子解析法の改良を試みた。

結果と考察

策定した（RT-）PCR法のマニュアルで豚扁桃を調査しブタサーコウイルス2型とブタパルボウイルスが検出されたが、E型肝炎ウイルスや他の8種のウイルスは検出されなかった。以前の結果と類似し、本マニュアルで安定した検査結果が得られると考えられた。牛白血病ウイルス検査PCR法で新たな耐熱性DNAポリメラーゼを用い検査時間の大幅な短縮と高感度化に成功した。さらに、陽性対照DNAを調製できたことで本改良法の協力食肉衛生検査所での試行ができた。また、本ウイルスのTax遺伝子解析で国内のウイルスは2系統あり、発症年齢との関連性が示唆された。ニューカッスル病ウイルス検出RT-LAMP法は幅広い型のウイルス株で検出可能でかつ、実験感染鶏からの検出も可能であった。MPH法でインフルエンザウイルスゲノムの104コピーを検出できた。A群ロタウイルスが健康豚の9.6%から人や豚に病原性を示すタイプを含めウイルス遺伝子の排泄が確認された。また、全分節遺伝子解析法の改良で前年度の検出率54.5%から81.8%に改善された

結論

家畜のウイルス疾病検査法として策定した（RT-）PCR法のマニュアルは多種類、多検体の処理が可能であることや牛白血病PCR検査が簡略化できたことで検査所に応用できると考えられる。鳥インフルエンザの鑑別検査法として有用迅速なRT-LAMP法が開発できた。低コスト汎用性のあるMPH法はさらに改良が必要である。各種遺伝子型のA群ロタウイルスが健康豚に存在することがわかった。

公開日・更新日

• 公開日: 2011-05-26
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201033013B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: 食肉食鳥衛生検査における家禽・家畜等のウイルス性疾病検査に関する研究
• 課題番号: H20-食品・一般-014
• 研究年度: 平成22(2010)年度
• 研究代表者(所属機関): 棚林 清(国立感染症研究所 獣医科学部)

研究分担者(所属機関)

• 岡崎　克則(北海道医療大学　薬学部)
• 池田　秀利(日本獣医生命科学大学　獣医学部)
• 伊藤　壽啓(鳥取大学　農学部)
• 杉山　誠(岐阜大学　応用生物科学部)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 食品の安心・安全確保推進研究
• 研究開始年度: 平成20(2008)年度
• 研究終了予定年度: 平成22(2010)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

食肉食鳥衛生検査所等で実施可能なウイルス性疾病の検査方法の開発・改良・検証を行いウイルス学的検査体制整備のための技術情報を提供することやウイルス疾病の実態調査を実施する。

研究方法

(1)各種ウイルスに応用可能なPCR検査法として検体の乳剤化・核酸抽出・PCR検出までのマニュアルを策定し検証した。(2)牛の疾病モデルとして牛白血病ウイルス(BLV）ゲノム検出法を改良し検査所での試行と検出ウイルスの解析を行った。(3)高病原性鳥ンフルエンザ(HPAI)の初期検査手技のマニュアル案の作成や検体輸送培地や温度を検討した。また、鑑別が必要となるニューカッスル病ウイルス(NDV)検出LAMP法を開発した。(4)試作病原体検出マイクロアレイの応用とそのプローブを利用した簡易検査法の開発を試みた。(5)家畜におけるA群ロタウイルスの感染状況やゲノム解析法の改良およびエゾシカでのE型肝炎ウイルス(HEV)の検出を実施した。

結果と考察

(1)一連のPCR検査手法をマニュアル化し、これに従って豚扁桃で10種のウイルスを調べ、過去の調査結果とほぼ類似した安定した結果が得られた。(2)PCR法で牛の腫瘍95.3％からBLV遺伝子が検出された。PCR法の改良と陽性対照DNA作成により検査時間の短縮と高感度化ができ協力検査所でも実施可能であった。また、国内分布BLVに遺伝子型があることや発症までの期間に関連性があることが示唆された。(3) 簡易キットによるHPAI検査手技の図解マニュアル案を実地検討し作成した。検体輸送は冷蔵管理が重要であった。インフルエンザウイルス(FluV)の詳細解析のための全分節増幅法を確立した。開発したLAMP法は幅広い型のNDV検出に有効だった。(4) 試作病原体検出マイクロアレイで牛や豚廃棄臓器から放線菌ゲノムなどが検出された。このプローブはFluV亜型型別やマイクロプレートハイブリダイゼーション法に応用できた。(5)牛や豚の糞便からA群ロタウイルスが検出され遺伝子分節組換えや遺伝子内組換えが頻繁に認められた。簡便な全遺伝子解析法を改良した。エゾシカからGenotype 3のHEVゲノムが検出された。

結論

ウイルス学的検査は煩雑であるがPCR法等の核酸検出法は比較的簡易であり、ウイルス検査や解析が食肉食鳥検査で実施されることが期待される。また、食用となる家畜以外の動物の継続した調査も必要と考えられる。

公開日・更新日

• 公開日: 2011-05-31
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201033013C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 食肉検査で発見される牛腫瘍の多くが牛白血病ウイルスによることや、国内分布ウイルスの遺伝子型を解析した。また、発症までの期間との関連性が示唆された。; また、牛糞便から各種方のＡ群ロタウイルスが検出され、その遺伝子型の簡易解析方法を開発した。インフルエンザウイルスの詳細解析のための遺伝子増幅法を開発した。高病原性鳥インフルエンザとの鑑別診断が必要なニューカッスル病ウイルス検出ＬＡＭP法を開発した
• 臨床的観点からの成果: 食肉処理される豚でのウイルス検出を実施しブタサーコウイルス2型やブタパルボウイルスが検出された。食肉検査で発見された牛腫瘍の95.3％で牛白血病ウイルス遺伝子が検出された。食肉処理される牛糞便からＡ群ロタウイスルが検出された。エゾシカにおいてＥ型肝炎ウイルスの感染が確認された。
• ガイドライン等の開発: 高病原性鳥インフルエンザが疑われた場合の食鳥検査所での簡易キット検査手法の図解マニュアルを作成した。また、各種ウイルス検査に応用可能な動物臓器中ウイルスの核酸抽出からRT-PCRまたはPCRによる遺伝子検出マニュアルを作成した。
• その他行政的観点からの成果: 高病原性鳥インフルエンザが疑われた場合の簡易検査キットによる検査手法の図解マニュアル作成や検査所でのキットの試用を行った。また検体輸送方法の検討を行った。牛白血病ウイルスゲノムのＰＣＲ検査を簡易迅速化することができ検査所で実施可能であることが検査所での試行でわかった。
• その他のインパクト: マイクロアレイ技術を応用した網羅的病原体検出マイクロアレイを試作した。特願2009-25818「病原体を検出するためのマイクロアレイ又はそれを含むキット」宇田晶彦他

発表件数

• 原著論文（和文）: 1件 ; 処理場で採材した豚扁桃に対する各種ウイルス遺伝子調査
• 原著論文（英文等）: 6件 ; 牛のロタウイスル、インフルエンザＡウイルス、牛白血病ウイルス等に関する論文
• その他論文(和文): 0件
• その他論文(英文等): 17件 ; インフルエンザウイルス等に関する論文
• 学会発表(国内学会): 25件 ; 牛のロタウイスル、インフルエンザＡウイルス、牛白血病ウイルス等に関する研究発表
• 学会発表(国際学会等): 1件 ; Ｅ型肝炎ウイルスに関する研究発表
• その他成果(特許の出願): 0件 ; 「出願」「取得」計1件
• その他成果(特許の取得): 0件 ; 特願2009-25818「病原体を検出するためのマイクロアレイ又はそれを含むキット」宇田晶彦他
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Tomiyama,D., Inoue, E., Osawa Y. et al.; Serological evidence of infection with hepatitis E virus amang wild Yezo-deer, Cervus nippon yesoensis, in Hokkaido, Japan; Journal of Virus Hepatitis , 16 (7) , 524-528 (2009)
• 原著論文2: Inoue, E., Wang, X., Osawa,Y.etal; Full genomic amplification and subtyping of influenza A virus using a single set of universal primers.; Microbiol. Immunol. , 54 (3) , 129-134 (2010)
• 原著論文3: Abe, M., Ito, N., Morikawa, S. et al; Molecular epidemiology of rotaviruses among healthy calves in Japan: Isolation of a novel bovine rotavirus bearing new P and G genotypes.; Virus Res , 144 (1) , 250-257 (2009)
• 原著論文4: Matsumura, K., Inoue, E., Osawa, Y.,et al.; Molecular epidemiology of bovine leukemia virus associated with enzootic bovine leukosis in Japan.; Virus Res , 155 , 343-348 (2011)
• 原著論文5: Inoue, E., Matsumura, K., Maekawa1, K.,et al; Genetic heterogeneity among bovine leukemia viruses in Japan and its relationship to leukemogenicity.; Arch. Virol. (2011)
• 原著論文6: Abe, M., Ito, N.a, Masatani, T. et al.; Whole genome characterization of new bovine rotavirus G21P[29] and G24P[33] strains provides evidence for interspecies transmission.; J. Gen. Virol. , 92 (4) , 952-960 (2011)
• 原著論文7: 三井寛子、赤崎 創、久保田智江 et al; 処理場で採材した豚扁桃に対する各種ウイルス遺伝子調査; 家畜衛生学雑誌 , 36 , 10-11 (2010)

公開日・更新日

• 公開日: 2013-05-27
• 更新日: -

収支報告書

• 文献番号: 201033013Z