スプライシングを利用した筋強直性ジストロフィーの治療

文献情報

• 文献番号: 201027063A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: スプライシングを利用した筋強直性ジストロフィーの治療
• 研究課題名（英字）: -
• 課題番号: H20-こころ・一般-017
• 研究年度: 平成22(2010)年度
• 研究代表者(所属機関): 石浦 章一(東京大学 大学院総合文化研究科)

研究分担者(所属機関)

• 西野一三(国立精神・神経医療研究センター)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 障害者対策総合研究
• 研究開始年度: 平成20(2008)年度
• 研究終了予定年度: 平成22(2010)年度
• 研究費: 10,000,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

筋強直性ジストロフィー（DM）は遺伝子が伸長することによる全身性疾患で、遺伝的にDM1とDM2の2種類が報告されている。DM1はDMPK遺伝子の非翻訳領域のCTGリピートの伸長、DM2はZNF9遺伝子のイントロン1にあるCCTGリピートの伸長が原因で発症する。症状は、長く伸びたRNAのCUG3塩基リピートまたはCCUG4塩基リピートにMBNL1やCUG-binding protein (CUG-BP)などのRNA結合タンパク質がトラップされ、正常の機能であるスプライシングができなくなることで生じるので、本症は「RNA病」であると言われている。そのため、スプライシングを正常化することが治療の第一選択となっている。

研究方法

この目的のためにはRNAリピートに結合するスプライシング調節タンパク質の発現を加減することによって、正常化スプライシングを導くという戦略と、薬物添加やアンチセンスの手法を用いてスプライシング自体を変化させるものがある。本研究では、後者の方法を検討した。また、分担研究者の西野の協力の下、DM患者筋を用いた新しいスプライシング異常の検出も行った。ミオトニアに直接関係する塩素チャネル遺伝子に注目し、ミニ遺伝子を作製してスプライシング・アッセイ系を構築し、スプライシング調節活性を持つMBNL1の標的配列を明らかにすることを目的とした。次に、この配列を標的としたエクソンスキッピングを行い、スプライシング機能を正常化する新規DM治療法の開発を目指した。

結果と考察

エクソン7aの最初の塩基を1として、-15～10、0～25、26～50、51～75、76～+21をコードする各アンチセンスを、塩素チャネル・ミニ遺伝子をトランスフェクトしたCOS-7細胞に添加して効果を見たところ、エクソン7aの0～25に対するアンチセンスを投与したときに、7a含有型の割合が約50％から10％に低下した。この抑制結果は、以前報告のあったWheelerらのアンチセンスより高く、筋強直の治療に使えるものと考えられた。生体内への保持能力の高いモルフォリノアンチセンスオリゴの効果は培養細胞系で確認ずみのため、このオリゴ人工的にリピートを300に増やしたHSALR-マウスの前脛骨筋に注射し、効果を筋強直を指標に判定した。その結果、筋強直症状が大幅に改善されていることがわかった。

結論

3年間の研究により、エクソンスキッピングは、DMの効果的治療になるのではないかと結論づけられた。

公開日・更新日

• 公開日: 2011-06-09
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201027063B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: スプライシングを利用した筋強直性ジストロフィーの治療
• 研究課題名（英字）: -
• 課題番号: H20-こころ・一般-017
• 研究年度: 平成22(2010)年度
• 研究代表者(所属機関): 石浦 章一(東京大学 大学院総合文化研究科)

研究分担者(所属機関)

• 西野　一三(国立精神・神経医療研究センター)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 障害者対策総合研究
• 研究開始年度: 平成20(2008)年度
• 研究終了予定年度: 平成22(2010)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

筋強直性ジストロフィー（DM）はスプライシング異常を伴う全身性の疾患で、遺伝的にDM1とDM2の2種類が報告されており、前者は長く伸びたCTG3塩基リピート、後者はCCTG4塩基リピートの伸長が直接の病気の原因である。これらの長く伸びたmRNAに、RNA結合タンパク質（MBNL1やCUG結合タンパク質）がトラップされて、通常行っている正常のスプライシング機能が果たせなくなることが病気の直接の原因である。筋強直や耐糖能異常は、それぞれ塩素チャネルやインスリン受容体のスプライシングが異常となり、結果として幼若型（低活性）のタンパク質がつくられることが原因で起こる。
　本研究では、特徴的な症状であるミオトニア治療にアンチセンスモルフォリノを用い、モデルマウスで治療に成功した。

研究方法

RNAリピートに結合しスプライシングを調節するタンパク質としてMBNL1を同定し、DMの筋強直症状を試験管内で再現する塩素チャネル・スプライシングアッセイ系を確立した。次に、このミニ遺伝子を導入した細胞を用いて塩素チャネル遺伝子のスプライシングに関わる配列を同定し、この配列を含むアンチセンスを導入することによって、スプライシングを異常型から正常型に変えてほぼ90％以上正常型塩素チャネルを作ることに成功した。
　次に、配列を同じにして、モルフォリノアンチセンスを合成し、DMのモデルマウスHSA-LRマウスに筋注を行い、ミオトニアを測定した。

結果と考察

CTGリピートを300含むトランスジェニックマウスに対して、私たちが新しく開発したアンチセンスモルフォリノオリゴ配列は劇的な治療効果をもたらした。今後は、ドラッグデリバリーの効率を高めることと、実際のQOLに必要な筋萎縮を防ぐために、筋力低下に関わる新規遺伝子を同定することが必要となると考えられた。

結論

ミオトニアには、アンチセンス治療が最適であることが判明した。

公開日・更新日

• 公開日: 2011-06-09
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201027063C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 塩素チャネル遺伝子のスプライシングをアンチセンスで変えることが可能になった。そのため、難病と考えられていた筋強直性ジストロフィーの薬物治療が可能になったことは大きなインパクトがある。
• 臨床的観点からの成果: 筋強直性ジストロフィーの特長的な症状が、効果的なアンチセンス投与によって改善した。これは、世界でもまれな結果であり、将来的な薬剤の開発に希望が出てきた。
• ガイドライン等の開発: なし
• その他行政的観点からの成果: なし
• その他のインパクト: 平成22年度の筋ジストロフィーの総合班会議の発表演題に選ばれた。

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 11件
• その他論文(和文): 5件
• その他論文(英文等): 1件
• 学会発表(国内学会): 10件
• 学会発表(国際学会等): 5件
• その他成果(特許の出願): 0件 ; 「出願」「取得」計0件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Mori, D., Sasagawa, N., Kino, Y. et al.. ; Quantitative analysis of CUG-BP1 binding to RNA repeats. ; J.Biochem. , 143 , 377-383 (2008)
• 原著論文2: Dhaenens , M-C., Schraen-Maschke , S., Tran, H., et al. ; Overexpression of MBNL1 fetal isoforms and modified splicing of tau in the DM1 brain: two individual consequences of CUG trinucleotide repeats. ; Exp.Neurol. , 210 , 467-478 (2008)
• 原著論文3: Onishi, H., Kino, Y., Morita. T., et al. ; MBNL1 associates with YB-1 in cytoplasmic stress granules. ; J.Neurosci.Res. , 86 , 1994-2002 (2008)
• 原著論文4: Sasagawa, N., Ohno, E., Kino, Y., et al. ; Identification of Caenorhabditis elegans K02H8.1 (CeMBL) as a functional ortholog of the mammalian MBNL proteins. ; J.Neurosci.Res. , 87 , 1090-1097 (2009)
• 原著論文5: Oyama, S., Yamakawa, H., Futai, E., et al. ; Dysbindin-1, a schizophrenia-related protein, functionally interacts with the DNA- dependent protein kinase complex in an isoform-dependent manner. ; PLoS ONE , 4 , 4199- (2009)
• 原著論文6: Goto, A., Wang, Y-L., Kabuta, T., et al. ; Proteomic and histochemical analysis of proteins involved in the dying-back-type of axonal degeneration in the gracile axonal dystrophy (gad) mouse. ; Neurochem.Int. , 54 , 330-338 (2009)
• 原著論文7: 7. Nojima, J., Oma, Y., Futai, E., et al.; Biochemical analysis of oligomerization of expanded polyalanine repeat proteins. ; J.Neurosci.Res. , 87 , 2290-2297 (2009)
• 原著論文8: 8. Toriumi, K., Oma, Y., Mimoto, A., et al. ; Polyalanine tracts directly induce the release of cytochrome c, independently of the mitochondrial permeability transition pore, leading to apoptosis. ; Genes to Cells , 14 , 751-757 (2009)
• 原著論文9: 9. Kino. Y., Washizu, C., Oma, Y., et al.; MBNL and CELF proteins regulate alternative splicing of the skeletal muscle chloride channel CLCN1. ; Nucleic Acid Res. , 37 , 6477-6490 (2009)
• 原著論文10: Sasabe, T., Futai, E. & Ishiura, S. ; Polypyrimidine tract-binding protein 1 regulates the alternative splicing of dopamine receptor D2.; J.Neurochem. , 116 , 76-81 (2011)
• 原著論文11: Ohsawa, N., Koebis, M., Suo, S., et al. ; Alternative splicing of PDLIM3/ALP, for <alpha>-actinin-associated LIM protein 3, is aberrant in persons with myotonic dystrophy. ; Biochem.Biophys.Res.Commun. , 409 , 64-69 (2011)

公開日・更新日

• 公開日: 2015-05-20
• 更新日: -

収支報告書

• 文献番号: 201027063Z