新規生体膜生合成酵素と生理活性脂質（PAF）生合成酵素の機能解析

文献情報

• 文献番号: 201023046A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: 新規生体膜生合成酵素と生理活性脂質（PAF）生合成酵素の機能解析
• 課題番号: H20-免疫・若手-028
• 研究年度: 平成22(2010)年度
• 研究代表者(所属機関): 進藤 英雄(東京大学 大学院医学系研究科)
• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 免疫アレルギー疾患等予防・治療研究
• 研究開始年度: 平成20(2008)年度
• 研究終了予定年度: 平成22(2010)年度
• 研究費: 8,100,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

生体膜の主成分であるリン脂質は組織や細胞によって多種多様であり、血小板活性化因子(PAF)のような炎症性物質も含まれる。PAFは炎症や免疫を惹起する強力なメディエーターである。この生体膜の多様性は、脂肪酸を再結合させるリゾリン脂質アシル転移酵素によるリン脂質の代謝回転によって作られ、50年前にランズ回路と名付けられている。私達は新規酵素を6種類同定している。中には血小板活性化因子（PAF）生合成酵素を2種類含み、リゾホスファチジルコリンアシル転移酵素（LPCAT）1とLPCAT2と名付けた。LPCAT2はマクロファージにおいてリポポリサッカライド（LPS）刺激で活性化や遺伝子誘導されることもわかった。これらの酵素群の機能解析を行うことによって、マクロファージなどの炎症細胞での生体膜形成メカニズムやPAF産生メカニズムを解明する。

研究方法

　RAW264.7細胞にLPCAT1とLPCAT2を過剰発現させてリポポリサッカライド（LPS）で30分間刺激した。これらの試料をphos-tag SDS-PAGEで解析した。phos-tagはリン酸化タンパク質と結合しSDS-PAGE上バンドをシフトさせるものである。
　シフトしたバンドを切り出し回収し、質量分析計で解析し、リン酸化部位を34番目のSerと特定した。
　LPCAT2をリン酸化する分子を調べるためLPSシグナル下流分子であるTAK1、p38 MAPK、MK2の阻害剤の効果を調べた。MK2 siRNAも用いて同様に調べた

結果と考察

LPCAT2は活性化されリン酸化された。LC-MS解析と変異体解析から34番目のSerがリン酸化部位であると推定された。ほ乳動物によく保存されている。
MK2の阻害剤でLPCAT2リン酸化が阻害された。MK2 siRNAも同様の効果を示し、LPCAT2リン酸化が抑制された。MK2がLPCAT2をリン酸化している可能性が高い。今後は阻害剤などの開発が重要になる。

結論

今回新たにLPCAT2のリン酸化部位が明らかになった。活性化型LPCAT2の解明によりLPCAT2活性化メカニズムが解析された。今後、2種類のPAF生合成酵素（恒常型LPCAT1と誘導型LPCAT2）の比較が望まれる。PAFの生合成メカニズムの解明は炎症やアレルギーの新しい治療方法の開発につなげられるであろう。

公開日・更新日

• 公開日: 2011-09-30
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 201023046B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: 新規生体膜生合成酵素と生理活性脂質（PAF）生合成酵素の機能解析
• 課題番号: H20-免疫・若手-028
• 研究年度: 平成22(2010)年度
• 研究代表者(所属機関): 進藤 英雄(東京大学 大学院医学系研究科)
• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 免疫アレルギー疾患等予防・治療研究
• 研究開始年度: 平成20(2008)年度
• 研究終了予定年度: 平成22(2010)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

　生体膜の主成分であるリン脂質は組織や細胞によって多種多様であり、血小板活性化因子(PAF)のような炎症性物質も含まれる。PAFは炎症や免疫を惹起する強力なメディエーターである。この生体膜の多様性はランズ回路でリゾリン脂質アシル転移酵素によって形成されるが、約50年間分子同定されていなかった。近年リゾリン脂質アシル転移酵素分子が次々と同定され、私達はそのうち6種類の同定に成功した。中にはPAF生合成酵素を含んだ。PAF生合成酵素は2種類存在し、リゾホスファチジルコリンアシル転移酵素（LPCAT）1とマクロファージに多いLPCAT2である。LPCAT1やLPCAT2を中心に解析し、炎症細胞での生体膜形成メカニズムやPAF産生メカニズムを解明する。

研究方法

データベースを利用して新規酵素を探索した。点変異体解析を行い酵素活性モチーフを探索した。MSを利用してLPCAT2のリン酸化部位を同定した。

結果と考察

新規にLPAAT3を同定した。精巣に週齢依存的に発現し性成熟に関与する可能性がある。新規にMBOATモチーフを同定した。これらは新規酵素探索や阻害剤の開発に有効である。LPCAT2のリン酸化部位を同定した。活性化型LPCAT2がわかりPAF生合成の阻害剤開発に利用できる。

結論

新規酵素としてLPAAT3を同定できた。アシル転移酵素ファミリーであるMBOATファミリーの新規モチーフを同定できた。また、ヒトLPCAT1の解析からAGPATモチーフの解析も行った。LPCAT2はリン酸化されて活性化されることがわかった。そのリン酸化部位もSer34と同定できた。これらの情報からリゾリン脂質アシル転移酵素の解析が進んだ。またPAF生合成酵素であるLPCAT1とLPCAT2の解析からPAF産生メカニズムの一端が解明された。

公開日・更新日

• 公開日: 2011-09-30
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 201023046C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: 三年目には新たにLPCAT2のリン酸化部位が明らかになった。2種類のPAF生合成酵素（恒常型LPCAT1と誘導型LPCAT2）のそれぞれに特異的な阻害剤などの開発が望まれる。PAFの生合成メカニズムの解明は炎症やアレルギーの新しい治療方法の開発につなげられるであろう。以降、精巣に置ける高度不飽和脂肪酸のリン脂質への取り込みメカニズム解析や生理活性脂質パルミトレイン酸のPIへの取り込みなどを発表した。
• 臨床的観点からの成果: なし
• ガイドライン等の開発: なし
• その他行政的観点からの成果: なし
• その他のインパクト: なし

発表件数

• 原著論文（和文）: 0件
• 原著論文（英文等）: 9件
• その他論文(和文): 0件
• その他論文(英文等): 0件
• 学会発表(国内学会): 29件
• 学会発表(国際学会等): 8件
• その他成果(特許の出願): 0件 ; 「出願」「取得」計0件
• その他成果(特許の取得): 0件
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 0件

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Yuki, K., Shindou, H., Hishikawa, D., et al.; Characterization of mouse lysophosphatidic acid acyltransferase 3: An enzyme with dual functions in the testis.; J. Lipid Res. , 50 , 860-869 (2009)
• 原著論文2: Shindou H., Hishikawa D., Harayama T., et al.; Recent progress on Acyl-CoA:lysophospholipid acyltransferase research.; J. Lipid Res. , 50 , 46-51 (2009)
• 原著論文3: Shindou H. and Shimizu T.; Acyl-CoA:lysophospholipid acyltransferases.; J. Biol. Chem. , 284 , 1-5 (2009)
• 原著論文4: Harayama T., Shindou H., and Shimizu T..; Biosynthesis of phosphatidylcholine by human lysophosphatidylcholine acyltransferase 1.; J. Lipid Res. , 50 , 1824-1831 (2009)
• 原著論文5: Shindou H., Eto M., Morimoto R., et al.; Identification of membrane O-acyltransferase family motifs.; BBRC , 383 , 320-325 (2009)
• 原著論文6: Morimoto R, Shindou H, Oda Y, et al.; Phosphorylation of lysophosphatidylcholine acyltransferase 2 at Ser34 enhances platelet-activating factor production in endotoxin-stimulated macrophages; J. Biol. Chem. , 285 , 29857-29862 (2010)
• 原著論文7: Koeberle A., Shindou H., Harayama T., et al.; Role of lysophosphatidic acid acyltransferase 3 for the supply of highly polyunsaturated fatty acids in TM4 Sertoli cells; FASEB J. , 24 , 4929-4938 (2010)
• 原著論文8: Koeberle A, Shindou H, Harayama T., et al; Polyunsaturated fatty acids are incorporated into maturating male mouse germ cells by lysophosphatidic acid acyltransferase 3. ; FASEB J. , 26 , 169-180 (2012)
• 原著論文9: Koeberle A, Shindou H, Harayama T., et al; Palmitoleate is a mitogen, formed upon stimulation with growth factors, and converted to palmitoleoyl-phosphatidylinositol.; J. Biol. Chem. , 287 , 27244-27254 (2012)

公開日・更新日

• 公開日: 2015-06-30
• 更新日: -

収支報告書

• 文献番号: 201023046Z