Ｃ型肝炎新規治療開発に資するプロテオーム解析を用いた治療標的分子の網羅的検索系とヒト肝細胞キメラマウスＨＣＶ感染モデルを用いた実証系の開発に関する研究

文献情報

• 文献番号: 200728001A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: Ｃ型肝炎新規治療開発に資するプロテオーム解析を用いた治療標的分子の網羅的検索系とヒト肝細胞キメラマウスＨＣＶ感染モデルを用いた実証系の開発に関する研究
• 課題番号: H17-肝炎-一般-006
• 研究年度: 平成19(2007)年度
• 研究代表者(所属機関): 茶山 一彰(広島大学病院消化器内科)

研究分担者(所属機関)

• 松浦　善治(大阪大学微生物病研究所分子ウイルス分野)
• 金子　周一(金沢大学大学院医学系研究科恒常性制御学)
• 土方　誠(京都大学ウイルス研究所ヒトがんウイルス研究分野)
• 高倉　喜信(京都大学大学院薬学研究科病態情報薬学分野)
• 榎本　信幸(山梨大学医学部第1内科)
• 高橋　祥一(広島大学病院消化器内科)
• 吉里　勝利((株)フェニックスバイオ)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 肝炎等克服緊急対策研究
• 研究開始年度: 平成17(2005)年度
• 研究終了予定年度: 平成19(2007)年度
• 研究費: 68,970,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

我々は、C型肝炎ウイルス（HCV）陽性患者血清の投与により、HCVに感染するマウスモデルの作製に取り組んできた。このマウスを使用し、HCVの感染実験を行い、さらにはHCVクローンを用いて、リバースジェネティックスの系も確立した。これらの研究を発展させるため、genotype 1b型のHCVクローンを用いた感染マウスの作製を行った。

研究方法

Genotype 2a型HCVのJFH-1株よりRNAを合成し、Huh7細胞株にトランスフェクションした。培養上清に産生されたウイルスをヒト肝細胞キメラマウスに経静脈的に投与した。またgenotype 1aの感染性HCVクローンも使用し、感染実験を行った。さらに、genotyoe1b型の重症急性C型肝炎患者の血清よりHCV全長をクローニングし、このクローンを用いた感染実験も行った。

結果と考察

JFH-1株をtransfectionし、上清に産生されたウイルスをマウスに静脈内に投与した。投与２週目からHCV RNAが陽性となり、その後もウイルス血症が持続した。1a型のCV-H77Cクローンは細胞内でウイルス粒子を作ることは明らかでないため、RNAを直接マウス肝臓に接種したところ、接種２週後から定量可能なウイルス血症が認められた。さらに1b型の感染実験にも取り組んだ。1b型の重症急性C型肝炎患者の血清よりHCV全長をクローニングした。同じアミノ酸配列でも、U-stretchが115 bpと最も長いクローン（KT9）および86 bpと最も短いクローン（KT1）の2種類をクローニングした。KT9の RNAを肝臓内に注入したところ、10頭中8頭のマウスで感染が確認された。一方、KT1を投与したマウスでは、感染の成立は7頭中1頭のみであり、この1頭の血中HCV RNAの増加は緩やかであった。U-stretchの長さの違いによるHCV増殖の違いは、レプリコン細胞を用いた報告があるが、われわれは、in vivoにおいても、U-stretchが長いほど、HCVの感染、増殖に有利であることを見いだした。これらのマウスにインターフェロン（IFN）を投与したところ、1aおよび 1b型感染マウスは2a型感染マウスよりもIFNの効果が不良であり、臨床的に経験されるgenotypeによるIFN効果の差異がマウス内で再現されていた。

結論

キメラマウスを用いてHCVのリバースジェネティックスの系を構築することができた。この手法により種々の変異ウイルスを血中に有するマウスの作製が可能であり、生体内における肝炎ウイルスの分子生物学的な検討に、広く応用が可能であると思われる。

公開日・更新日

• 公開日: 2008-04-09
• 更新日: -

文献情報

• 文献番号: 200728001B
• 報告書区分: 総合
• 研究課題名: Ｃ型肝炎新規治療開発に資するプロテオーム解析を用いた治療標的分子の網羅的検索系とヒト肝細胞キメラマウスＨＣＶ感染モデルを用いた実証系の開発に関する研究
• 課題番号: H17-肝炎-一般-006
• 研究年度: 平成19(2007)年度
• 研究代表者(所属機関): 茶山 一彰(広島大学病院消化器内科)

研究分担者(所属機関)

• 吉里　勝利((株)フェニックスバイオ)
• 金子　周一(金沢大学大学院医学系研究科恒常性制御学)
• 土方　誠(京都大学ウイルス研究所ヒトがんウイルス研究分野)
• 高倉　喜信(京都大学大学院薬学研究科病態情報薬学分野)
• 榎本　信幸(山梨大学医学部第1内科)
• 松浦　善治(大阪大学微生物病研究所分子ウイルス分野)
• 高橋　祥一(広島大学自然科学研究支援開発センター)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 疾病・障害対策研究分野 肝炎等克服緊急対策研究
• 研究開始年度: 平成17(2005)年度
• 研究終了予定年度: 平成19(2007)年度
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

我々は、C型肝炎ウイルス（HCV）陽性患者血清の投与により、HCVに感染するマウスモデルの作製に取り組んできた。このマウスを使用し、HCVの感染実験を行い、さらにはHCVクローンを用いて、リバースジェネティックスの系も確立した。これらの研究を発展させるため、genotype 1b型のHCVクローンを用いた感染マウスの作製を行った。

研究方法

Genotype 2a型HCVのJFH-1株よりRNAを合成し、Huh7細胞株にトランスフェクションした。培養上清に産生されたウイルスをヒト肝細胞キメラマウスに経静脈的に投与した。またgenotype 1aの感染性HCVクローンも使用し、感染実験を行った。さらに、genotyoe1b型の重症急性C型肝炎患者の血清よりHCV全長をクローニングし、このクローンを用いた感染実験も行った。

結果と考察

JFH-1株をtransfectionし、上清に産生されたウイルスをマウスに静脈内に投与した。投与２週目からHCV RNAが陽性となり、その後もウイルス血症が持続した。1a型のCV-H77Cクローンは細胞内でウイルス粒子を作ることは明らかでないため、RNAを直接マウス肝臓に接種したところ、接種２週後から定量可能なウイルス血症が認められた。さらに1b型の感染実験にも取り組んだ。1b型の重症急性C型肝炎患者の血清よりHCV全長をクローニングした。同じアミノ酸配列でも、U-stretchが115 bpと最も長いクローン（KT9）および86 bpと最も短いクローン（KT1）の2種類をクローニングした。KT9の RNAを肝臓内に注入したところ、10頭中8頭のマウスで感染が確認された。一方、KT1を投与したマウスでは、感染の成立は7頭中1頭のみであり、この1頭の血中HCV RNAの増加は緩やかであった。U-stretchの長さの違いによるHCV増殖の違いは、レプリコン細胞を用いた報告があるが、われわれは、in vivoにおいても、U-stretchが長いほど、HCVの感染、増殖に有利であることを見いだした。これらのマウスにインターフェロン（IFN）を投与したところ、1aおよび 1b型感染マウスは2a型感染マウスよりもIFNの効果が不良であり、臨床的に経験されるgenotypeによるIFN効果の差異がマウス内で再現されていた。

結論

キメラマウスを用いてHCVのリバースジェネティックスの系を構築することができた。この手法により種々の変異ウイルスを血中に有するマウスの作製が可能であり、生体内における肝炎ウイルスの分子生物学的な検討に、広く応用が可能であると思われる。

公開日・更新日

• 公開日: 2008-04-08
• 更新日: -

行政効果報告

• 文献番号: 200728001C

成果

• 専門的・学術的観点からの成果: B型あるいはC型肝炎の患者血清を用いて、マウスへのウイルス感染が可能となることを示した。さらにリバースジェネティックスが可能となり、この技術を利用し、薬剤耐性の変異型ウイルスを投与し、持続感染させることに成功した。さらに発展させ、genotype 1b型のHCV全長をクローニングし、このクローンを用いて、genotype 1b型のリバースジェネティックスの系を確立した。ウイルス学的解析、各種耐性ウイルスに対する治療薬の効果判定、感染の成立、予防に関する研究に有用なモデルになると考えられる。
• 臨床的観点からの成果: B型あるいはC型肝炎患者に対する抗ウイルス療法において、薬剤耐性株の出現は治療の大きな妨げとなっている。これら耐性株出現のメカニズムの解析やその対処法は早急に解決するべき問題点である。われわれが構築した種々の変異ウイルス感染マウスは、これらの問題点克服のため、有用なモデルであり、これを用いた研究結果は、ウイルス性肝炎患者の治療法に大きく寄与するものと思われる。
• ガイドライン等の開発: 特記事項なし。
• その他行政的観点からの成果: 特記事項なし。
• その他のインパクト: H17年からH19年にわたり、毎年、厚生労働省の共催により、広島大学肝臓研究センターシンポジウムを開催した。各シンポジウムは広島大学にて開催し、国内の肝臓研究者より一般演題を公募し、15?20題の一般演題の発表および特別講演から構成され、約80名が参加した。

発表件数

• 原著論文（和文）: 4件
• 原著論文（英文等）: 103件
• その他論文(和文): 0件
• その他論文(英文等): 0件
• 学会発表(国内学会): 50件
• 学会発表(国際学会等): 20件
• その他成果(特許の出願): 0件 ; 「出願」「取得」計1件
• その他成果(特許の取得): 0件 ; 土方班員：2007年9月26日出願、“肝炎ウイルスの増殖方法、及び肝炎ウイルス感染細胞を培養するための中空糸並びにその利用” 出願番号：PCT/JP2007/068611
• その他成果(施策への反映): 0件
• その他成果(普及・啓発活動): 3件 ; H17年よりH19年にわたり、毎年、広島大学にて厚生労働省との共催により、広島肝臓研究センターシンポジウムを開催した。

主な原著論文20編（論文に厚生労働科学研究費の補助を受けたことが明記された論文に限る）

• 原著論文1: Noguchi C, Ishino H, Tsuge M, et al.; G to A hypermutation of hepatitis B virus; Hepatology , 41 , 626-626 (2005)
• 原著論文2: Tsuge M, Takaishi H, Hiraga N, et al.; Infection of human hepatocyte chimeric mouse with genetically engeneered hepatitis B virus; Hepatology , 42 , 1046-1054 (2005)
• 原著論文3: Hatakeyama T, Noguchi C, Hiraga N, et al.; Serum HBV-RNA is a Predictor of Early Emergence of YMDD Mutant in Patients Treated with Lamivudine; Hepatology , 45 , 1179-1186 (2007)
• 原著論文4: Noguchi C, Hiraga N, Mori N, et al.; Dual effect of APOBEC3G on Hepatitis B virus. J Gen Virol; Journal of General Virology , 88 , 432-440 (2007)
• 原著論文5: Hiraga M, Imamura M, Tsuge M, et al.; Infection of human hepatocyte chimeric mouse with genetically engineered hepatitis C virus and its susceptibility to interferon; FEBS Letts , 581 , 1983-1987 (2007)
• 原著論文6: Emoto K, Tateno C, Hino H, et al.; Efficient In Vivo Xenogeneic Retroviral Vector-Mediated Gene Transduction into Human Hepatocytes; HUMAN GENE THERAPY , 16 , 1138-1174 (2005)
• 原著論文7: Utoh R, Tateno C, Yamasaki C, et al.; Susceptibility of Chimeric Mice with Livers Repopulated by Serially Subcultured Human Hepatocytes to Hepatitis B Virus; Hepatplogy (2008)
• 原著論文8: Takayuki Murata, Makoto Hijikata, Kunitada Shimotohno; Enhancement of internal ribosome entry site-mediated translation and replication of hepatitis C virus by PD98059; Virology , 340 , 105-115 (2005)
• 原著論文9: Naoto Ishii, Koichi Watashi, Takayuki Hishiki, et al.; Diverse effects of cyclosporine on hepatitis C virus strain replication; J. Virol. , 80 , 4510-4520 (2006)
• 原著論文10: Yusuke Miyanari, Kimie Atsuzawa, Nobuteru Usuda, et al.; The lipid droplet is an important organelle for hepatitis C virus production; Nat. Cell Biol. , 9 , 1089-1097 (2007)
• 原著論文11: Nakagawa M, Sakamoto N, Tanabe Y, et al.; Suppression of hepatitis C virus replication by cyclosporin A is mediated by blockade of cyclophilins; Gastroenterology , 129 , 1031-1041 (2005)
• 原著論文12: Simmonds P, Bukh J, Combet C, et al.; Consensus proposals for a unified system of nomenclature of hepatitis C virus genotypes; Hepatology , 42 , 962-973 (2005)
• 原著論文13: Sekine-Osajima Y, Sakamoto N, Nakagawa N, et al.; Development of plaque assays for hepatitis C virus and isolation of mutants with enhanced cytopathogenicity and replication capacity; Virology , 371 , 71-85 (2008)
• 原著論文14: Asahina Y, Izumi N, Hirayama I, et al.; Potential relevance of cytoplasmic viral sensors and related regulators involving innate immunity in antiviral response; Gastroenterology (2008)
• 原著論文15: Yoshinaga T, Yasuda K, Ogawa Y, et al. ; DNA and its cationic lipid complexes induce CpG motif-dependent activation of murine dendritic cells; Immunology , 120 , 295-302 (2007)
• 原著論文16: Moriishi K., Mochizuki R., Moriya K., et al.; Critical role of PA28_ in hepatitis C virus-associated steatogenesis and hepatocarcinogenesis; PNAS , 104 , 1661-1666 (2007)
• 原著論文17: Abe T., Kaname Y., Hamamoto I., et al.; Hepatitis C Virus Nonstructural Protein 5A Modulates TLR-MyD88-Dependent Signaling Pathway in the Macrophage Cell Lines; J. Virol , 81 , 8953-8966 (2007)
• 原著論文18: Mori Y., Yamashita T., Tanaka Y., et al.; Processing of Capsid Protein by Cathepsin L Plays a Crucial Role in Replication of the Japanese Encephalitis Virus in Neural and Macrophage Cells; J. Virol , 81 , 8477-8487 (2007)
• 原著論文19: Tani H., Komoda Y., Matsuo E., et al.; Replication-competent recombinant vesicular stomatitis virus encoding hepatitis C virus envelope proteins; J. Virol , 81 , 8601-8612 (2007)
• 原著論文20: Okamoto T. Nishimura Y., Ichimura T., et al.; Hepatitis C virus RNA replication is regulated by FKBP8 and Hsp90; MBO J , 25 , 5015-5025 (2007)

公開日・更新日

• 公開日: 2015-06-03
• 更新日: -