文献情報
文献番号
200400044A
報告書区分
総括
研究課題名
新規ヒト人工染色体ベクター開発と応用
課題番号
-
研究年度
平成16(2004)年度
研究代表者(所属機関)
押村 光雄(鳥取大学大学院医学系研究科)
研究分担者(所属機関)
- 栗政 明弘(鳥取大学大学院医学系研究科)
- 花岡 和則(北里大学理学部)
- 富塚 一磨(キリンビール（株）医薬カンパニー 医薬探索研究所)
- 井上 敏昭(鳥取大学大学院医学系研究科)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 厚生科学基盤研究分野 ヒトゲノム・再生医療等研究【ヒトゲノム遺伝子治療研究】
研究開始年度
平成14(2002)年度
研究終了予定年度
平成16(2004)年度
研究費
45,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
前年度までに構築したヒト21番染色体由来HACベクターについて、1）導入遺伝子の発現制御に関する性能、2）ヒト初代培養細胞への移入を検証し、3）21番染色体セントロメア領域のみを含む第2世代HACの構築および4）転座型HACによるジストロフィン遺伝子（DMD）ヒト化マウスの作出を行う。
研究方法
目的遺伝子発現ベクターとCre発現ベクターをHAC保持細胞に導入し、Ｇ418耐性を指標にloxP部位特異的挿入体を選別した。受容細胞へのHAC移入は、微小核細胞融合法により行った。
結果と考察
オステオポンチン遺伝子（骨芽細胞の分化マーカー）プロモーターにEGFP遺伝子を繋いでHACに搭載し、骨髄由来間葉系幹細胞（MSC）株に移入した。これを骨芽細胞に分化誘導し、GFP発現を確認した。抗フルオレセイン抗体/gp130受容体キメラ遺伝子を搭載したHACを構築してMSC株に移入し、抗原刺激に伴う分化誘導が確認できた。熱応答性発現を示すHSP70遺伝子プロモーターにプロインスリン遺伝子を繋ぎHT1080細胞内でHACに搭載し、50℃5分の熱処理によるプロインスリンの発現誘導を確認した。テトラサイクリン応答性制御配列にDNA-Pkcs遺伝子を繋いだ発現ユニットとトランス活性化因子発現ユニットを搭載したHACをDNA-Pkcs欠損CHO細胞（V3）内で構築し、DNA-Pkcs遺伝子の薬剤応答性発現を確認した。ヒトエリスロポエチン（EPO）遺伝子を搭載したHACを構築し、ヒト正常線維芽細胞に移入してEPO発現を確認した。EGFP-HACを骨髄由来細胞に移入し、G418耐性GFP発現コロニーの出現を確認するとともに、臍帯血由来CD34+細胞に移入して放射線照射NOD-SCIDマウスへの移植後、骨髄中にヒトCD45+GFP発現細胞の存在を確認した。DMD-HACを内在の相同遺伝子を欠損したマウスES細胞に移入してキメラマウスを作出したところ、組織特異的ヒトDMDアイソフォームの発現が示された。
結論
HACベクターの利用により、導入遺伝子の生理的、化学的、物理的発現制御が可能であり、HACはヒト初代培養細胞へ移入可能であることが示された。HACの利用により、DMD遺伝子をヒト化したキメラマウスの作出が可能であった。以上から、HACは遺伝子治療用ベクターとして有望であり、疾患モデル動物作製にも有効であることが明らかになった。
公開日・更新日
公開日
2005-04-13
更新日
-