ダイオキシン類等の化学物質の食品及び生体試料検査における信頼性確保と生体暴露モニタリング法の確立に関する研究

文献情報

• 文献番号: 200301193A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: ダイオキシン類等の化学物質の食品及び生体試料検査における信頼性確保と生体暴露モニタリング法の確立に関する研究
• 課題番号: -
• 研究年度: 平成15(2003)年度
• 研究代表者(所属機関): 柳澤 健一郎((財)食品薬品安全センター)

研究分担者(所属機関)

• 中澤裕之(星薬科大学)
• 織田　肇(大阪府立公衆衛生研究所)
• 米谷民雄(国立医薬品食品衛研究所)
• 松木容彦((財)食品薬品安全センター秦野研究所)

• 研究区分: 厚生労働科学研究費補助金 健康安全総合研究経費 食品医薬品等リスク分析研究（食品安全確保研究事業）
• 研究開始年度: 平成14(2002)年度
• 研究終了予定年度: 平成16(2004)年度
• 研究費: 85,150,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

ダイオキシン類は動物を用いた実験により、急性毒性、免疫毒性、発ガン性、生殖毒性等が強く疑われており、また、発現機序等についてもいまだ不明な点が多いことから、これら環境汚染化学物質による食物汚染やヒト体内暴露による国民健康への影響が懸念され、これらの化学物質の生活環境からの一日も早い低減化と環境改善対策が望まれる。一方、環境汚染化学物質の検査を目的とした検査機関から出される検査結果の信頼性が問われる問題も生じている。このような社会的背景下、環境汚染化学物質検査のみならず食品衛生検査や遺伝子組換え食品検査等も含め、検査機関から出力される検査データの信頼性保証を確保するための精度管理方策、すなわち、検査ガイドラインや操作マニュアルの整備、精度管理実施体制システムと信頼性保証担保システムの整備などについての具体的対応策を打ち出すことは行政上の取り組むべき重要かつ緊急な課題であり、その方法の開発や基礎的データの作成あるいは関連資料の提供を行うことが当研究班の研究目的である。本研究班では、平成14年度に引き続き、1.PCB代謝物および難燃剤成分のHRGC/MSモニタリング法の確立と精度評価に関する研究(中澤分担研究)、2.血液および母乳試料中ダイオキシン測定マニュアル実試料への適用性ならびに生体曝露に関する研究/臭素化ダイオキシン測定法の確立と測定操作マニュアル作成に関する研究(織田分担研究)、3.食品中ダイオキシン類分析の信頼性確保に関わる調査研究(米谷分担研究)、4.生体試料中ダイオキシンの簡易モニタリング法の実用性評価および臭素化ダイオキシンELISA確立に関する/食品衛生検査精度管理調査における適正調査試料作製と質的向上に関する調査研究(松木分担研究)の4研究課題を実施した。

研究方法

1.中澤分担研究:1)ダイオキシン類と類似毒性を示すヘキサクロロベンゼン(HCB)とダイオキシン類化合物の系統分析の確立とその総合的毒性評価を行った。 　2)ベビーフード中ダイオキシン類の分析とその摂取量評価について検討した。　2.織田分担研究:1)実試料(粉乳および血清試料)測定時の分析化学的問題への対処事項を検討し、既存の母乳中ならびに血液中ダイオキシン測定暫定マニュアルについて補足、改定した。　2)粉乳と血清試料を用い、試料少量化の分析法を検討し、マニュアルを作成した。　3)臭素化ダイオキシン類混合物標準液を用いてGC測定条件の適否、検出感度の確認および前処理条件についてマニュアルの追加、修正を行った。　3.米谷分担研究:1)市販の茶を粉砕し、混合した調査試料を作製し、分析機関(8機関)での技能試験を実施した。　2)ボラ可食部分の凍結乾燥試料を用い、試験者2名について9カ月間にわたり内部精度管理調査を実施した。4.松木分担研究:1)ダイオキシンELISAキットワコー(キット M:和光純薬工業)とイムノエコ DXN(キットP:コスモ石油)を用い、それぞれ8検査機関でのバリデーションを試みた。　2)臭素化ダイオキシンモノクローナル抗体を用い、PBDD/FsについてのELISA法を構築した。　3)外部精度管理調査の微生物検査における大腸菌同定検査法の培地条件や温度条件の適切性についての検証ならびに理化学検査における実食材調査試料作製を行った。　4)安全性審査承認済みダイズの外部精度管理調査の実施と調査試料の長期安全性の確認のための基礎検討を行った。　5)貝毒検査の外部精度管理調査のための調査試料作製に
おける基礎的検討を行った。

結果と考察

1.中澤分担研究:1)母乳試料を用い、HCBと主な有機塩素系農薬を分画法を確立した。HCB添加牛乳での回収率は68.1%(n= 4)であった。母乳試料中に含まれるHCBをHRGC/MSにより測定した結果、33.9 ng/g fatであった。2)ベビーフードを6種の食品カテゴリーに分類し、ダイオキシン含量を測定した。食品の摂取量を算出、設定し、ダイオキシンの1日摂取量を求めた結果、0.06 pg～1.2 pg TEQ/kgbw/dayであった。　2.織田分担研究:1)7機関での母乳試料について検討し、塩素化ダイオキシン測定操作マニュアルの妥当性を確認した。その時、脂肪含量は240 mg/g牛乳粉末(n=7)であった。7機関での試料中ダイオキシン測定結果はすべての類縁化合物質について、配布した試料中ダイオキシン濃度(保証値)より若干低い値を示した(PcDDs:82～94%、PcDFs:53～94%、1,2,3,7,8-PeCDF:53%)。同一試料3回測定における機関間変動係数は、大部分の類縁化合物質では30%内であったが、機関内変動は20%以内であった。また、また、内部標準物質の回収率は35～134%であった。　2)血漿中塩素化ダイオキシン類測定マニュアルに従って脂肪濃度を酵素法により測定した結果、一部の機関を除いて、ほぼ正確に抽出されていた。各ダイオキシン類測定値の機関間の変動係数は、30%を超えるものもあったが、TEQ換算値でみるといずれも変動係数は20%以内で、再現性は良好と判断された。機関内変動は良好であった。一部の類縁物質については操作ブランクに定量下限目標値を上廻り、かつ試料中濃度の1/10を超えるピークが認められ、汚染が確認された。内部標準物質の回収率は良好であった。　3)血清試料と粉乳試料ではおおむね少量注入法でも従来法とほぼ同等のダイオキシン値が得られた。血清脂質濃度は従来法のおおよそ1/2と低かったが、粉乳試料ではほぼ同等の値が得られた。　4)母乳臭素化ダイオキシン類測定のマニュアル作成において数種の測定標準物質の目標定量下値を設定した。検査に用いる分析試料量は50～100 gとした。分析前処理操作は基本的には塩素化ダイオキシンに準じることとした。検出下限について各機関の値を比較したところ、機関により1～2桁オーダの違いが認められ、再度、検討が必要となった。分析条件も新たに設定した。母乳試料について4～6臭素化ダイオキシン類を測定した結果、2,3,7,8-TeBDFが主成分であり、その他、数種のPBDDs成分が検出された。3.米谷分担研究:1)茶試料を用い、8ケ所のダイオキシン検査機関を対象に技能試験を実施し、結果を回収、解析中である。　2)試験者2名(A、B)について、昨年度作製したボラ可食部凍結乾燥試料を用い、内部精度管理を実施した結果、昨年度の技能試験結果より両者とも若干高いTEQ値を示した。また、両者の分析精度にはいくぶん差が認められ、測定濃度のRSDは試験者Aでは5.8%、試験者Bでは7.4%であった。また、TEQについての検査機関間におけるRSDは7.1%であった。個々の異性体ごと測定結果に両者で有意差は認められなかったが、Co-PCBでは差が認められた。一方、4週間隔、10回測定時の両試験者のデータについて各異性体濃度及びTEQをz-スコア化した結果、特に系統的な変化は見られず、今回用いた魚試料は内部精度管理試料として適用可能であることが示された。　4.松木分担研究:1)ELISAキットP(ポリクローナル抗体)では、各検量線濃度における参加9機関内の吸光度のRSDは1～10%(その多くは5%内)であり、機関間のRSDは若干大きいものの各機関の検量線の相関係数はいずれも0.99以上を示し、精度が良好であることが確認された。3濃度(高、中、低)の標準品測定時のキットPでの機関間のRSDはそれぞれ43%、32%および31%、また、機関内変動はそれぞれ14%、12%、および20%以内にあった。また、各機関の測定結果は理論値に近似していた。精製バター試料3濃度(高、中、低)についてキットPを用いて測定した結果、各濃度試料の機関内RSDはそれぞれ27%、13%および9%であり、各測定値は理論値と近似していた。ブランク試料と標準添加牛乳試料では、昨年度使用したキットM(モノクローナル抗体)における機関内RSDはブ
ランクで83%、添加試料で73%と大きかったが、機関内RSDはそれぞれ3%および23%と良好であった。キットPでは、機関間RSDは、59%および53%であり、機関内RSDはそれぞれ24%および17%であった。　2)昨年度作製したポリ臭素化ダイオキシンモノクローナル抗体を用い、ELISAによる測定法を確立した。　3)食品衛生微生物検査では、大腸菌10種について異なる培養条件でガス産生能について比較した結果、24時間培養でガス産生を示す菌種では107 cfu/mL以上の生菌の存在の必要性があること、また、ガス産生が認められない菌種では接種菌の発育を認めないか、増殖してもガス産生に十分な菌量に達していないことが確認された。増殖の経時変化とガス産生について比較した結果を併せるとガス産生能を検出指標とする場合、大腸菌種はその性状の違いにより3グループに分けられることが判明した。理化学検査では、均質性および安定性に優れた数種の添加試料を作製し、平成15年度の外部精度管理調査に供した。濃度の異なるカビ毒(デオキシニバレノールおよびニバレノール)汚染小麦2種を用いてカビ毒検査の外部精度管理調査用試料を作製した結果、均質でかつ目的濃度に調製された汚染小麦試料の作製が可能となった。　4)安全性審査済みの遺伝子組み換えダイズ試料を用い、外部精度管理調査を行った結果、ELISA法に参加した17機関の測定結果は混合重量比1%および5%試料のいずれも重量混合比に近似した値が得られた。定量PCR法に参加した22機関の測定結果は、低濃度、高濃度試料とも重量混合比よりも低い値が得られた。ダイズ調査試料について2日間、日を変えてDNA抽出を行い、指標波長、260 nmと280 nmの吸光度測定により、吸光度比および収量を求めた結果、機関内のRSDは比較的良好であったが、測定結果に日差が認められ、2日間の抽出操作手順の違いに基づく抽出DNAの品質差によると判断された。　

結論

1.中澤分担研究:ダイオキシン測定用母乳試料を用い、その分離分画に含まれるHCB、ヘプタクロルエポキシド、β-HCH、DDEsの分析が可能となった。実試料についてのHCB測定値についてWHO-TEF換算し、加算すると、総合毒性はダイオキシン対象の値に比し、おおよそ10%増となった。また、ベビーフード摂取量に基づき乳児のダイオキシン曝露を推定した結果、体重当りの1日摂取量はヒトのTDI基準を下廻った。　2.織田研究班:バリデーションにおける精度評価結果から、粉乳中塩素化ダイオキシン類も血液中塩素化ダイオキシン類も現行の測定マニュアルで実施可能であることが確認された。血清および粉乳試料の少量注入法についてマニュアル化した。母乳中臭素化ダイオキシン類についてより完成度の高い測定マニュアル案が作成できた。　3.米谷分担研究:昨年度作製した凍結乾燥魚試料の保存期間中の安定性とその内部精度管理への利用性の高いことが確認された。また、内部精度管理調査結果の解析により、試験者間の手技の差が、また、測定対象物毎のz-スコアの変動パターン解析により対象物別に変動要因が特定され、全体の変動要因への寄与が確認できた。　4.松木分担研究:ダイオキシン標準品ならびに添加牛乳試料を用い、開発したELISAキットMおよびキットPはともに許容できる範囲の測定精度を有していることが確認された。また、臭素化ダイオキシンモノクローナル抗体を用いるELISA法を新たに確立した。食品衛生外部精度管理における大腸菌同定検査のガス産生能について大腸菌種と培養条件との関連を明らかにした。理化学検査では適切な実食材類似の調査試料を作製した。遺伝子組換えダイズの外部精度管理調査において、ELISA法の精度管理が良好なこと、定量PCR法では、DNA抽出操作手順の違いにより測定結果に違いが認められ、DNAの品質が違いの主要因であることを明らかにした。貝毒検査については、保存期間中に生成する脂肪酸系毒素本体の解明のための分析法を確立した。

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