文献情報
文献番号
200300698A
報告書区分
総括
研究課題名
Ex.Vivo増幅臍帯血幹細胞を用いたトランスレーショナルリサーチ
課題番号
-
研究年度
平成15(2003)年度
研究代表者(所属機関)
中畑 龍俊(先端医療センター客員研究員、京都大学大学院発達小児科学)
研究分担者(所属機関)
- 前川平(京都大学医学部付属病院輸血部)
- 金倉譲(大阪大学大学院医学系研究科C9分子病態内科)
- 平家俊男(京都大学大学院発達小児科学)
- 清水則夫(東京医科歯科大学難治疾患研究所ウイルス感染学)
- 伊藤仁也(先端医療センター)
- 田中宏和(先端医療センター)
- 永井謙一(先端医療センター診療管理部)
- 村上雅義(先端医療センター臨床研究支援部)
- 逢坂敦(キリンビール・医薬カンパニーセルプロセッシングセンター)
- 白数昭雄(ニプロ株式会社総合研究所)
- 西川茂道(和研薬株式会社 R&D部)
- 桜田洋(ヘモネティクスジャパン株式会社)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 先端的厚生科学研究分野 基礎研究成果の臨床応用推進研究
研究開始年度
平成15(2003)年度
研究終了予定年度
平成16(2004)年度
研究費
91,186,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
我々は臍帯血中の造血幹細胞を5種のサイトカインSCF,FL,TPO,IL-6/sIL-6Rを用いて効率よく増幅する方法を開発し、この方法を用いた一週間の培養により、SCIDマウス中で長期にヒト造血細胞を支持できる幹細胞を4.3倍増幅させること、さらにこれまでの報告と比較して、より未分化性を維持した細胞を増幅し得ることを示してきた。
臍帯血移植は現在有効な移植方法として確立されてきたが、採取できる細胞数に限りがあるために生着不全が多い、対象患者が制限されるなどの問題点も明らかになってきた。これらの問題点を解決するために体外増幅させた臍帯血幹細胞を移植に用いることが期待されている。
我々は、基礎研究で得られた造血幹細胞の増幅技術を臨床に応用するとともに、我が国において開始途上の細胞治療・再生医療の基盤を整備することにより、新しい医療を用いた臨床研究の総合的な枠組みの構築を目的として本研究を開始した。
本年度は、体外で加工した細胞治療製剤を臨床応用していくにあたり、品質管理基準の設定、安全性の確認、免疫不全マウスを用いた効果の検証を行ない、実際に臍帯血バンクに保存されている凍結臍帯血を臨床応用可能なまで安全に増幅させられることができるのかどうか検証した。また細胞加工を行なう最適な環境基準を作成し、セルプロセッシングセンターでの環境衛生試験を行なうことにより科学的に裏づけされた標準作業手順書を作成にあたった。またセルプロセッシングのための基盤整備には、閉鎖系培養あるいは細胞洗浄に伴うデバイスの開発を目的に、C02インキュベータの開発、無菌閉鎖系細胞洗浄装置の開発を新たに加えた。臨床へ向けた取り組みとしては、今年度に発表された世界の他のグループでのex vivo expand臍帯血移植成績を分析し、培養法を追試することにより基礎的解析を行なった。
臍帯血移植は現在有効な移植方法として確立されてきたが、採取できる細胞数に限りがあるために生着不全が多い、対象患者が制限されるなどの問題点も明らかになってきた。これらの問題点を解決するために体外増幅させた臍帯血幹細胞を移植に用いることが期待されている。
我々は、基礎研究で得られた造血幹細胞の増幅技術を臨床に応用するとともに、我が国において開始途上の細胞治療・再生医療の基盤を整備することにより、新しい医療を用いた臨床研究の総合的な枠組みの構築を目的として本研究を開始した。
本年度は、体外で加工した細胞治療製剤を臨床応用していくにあたり、品質管理基準の設定、安全性の確認、免疫不全マウスを用いた効果の検証を行ない、実際に臍帯血バンクに保存されている凍結臍帯血を臨床応用可能なまで安全に増幅させられることができるのかどうか検証した。また細胞加工を行なう最適な環境基準を作成し、セルプロセッシングセンターでの環境衛生試験を行なうことにより科学的に裏づけされた標準作業手順書を作成にあたった。またセルプロセッシングのための基盤整備には、閉鎖系培養あるいは細胞洗浄に伴うデバイスの開発を目的に、C02インキュベータの開発、無菌閉鎖系細胞洗浄装置の開発を新たに加えた。臨床へ向けた取り組みとしては、今年度に発表された世界の他のグループでのex vivo expand臍帯血移植成績を分析し、培養法を追試することにより基礎的解析を行なった。
研究方法
I. GMPに準拠した培養法の確立
平成14年7月に薬事法が改正され、細胞治療製剤が定義されるとともにGTPに準拠した製造を義務づけられた。本研究ではより安全な培養を行なうため、無血清培養法の開発、培養原材料の検討、効果的な細胞融解法、分離法の検討、閉鎖系培養システムの構築などの開発を行った。
平成14年度の成果から培養に用いる培地、試薬の選択、サイトカインの至適濃度の決定は終了した。本年度は臍帯血バンクに凍結してある臍帯血を用いた細胞の解凍法の検討、Clinical gradeでのCD34陽性細胞の分離法の確立、バッグ培養による閉鎖系培養法の確立を行ない、臨床試験に備えた培養法の通し運転を行なうことにより標準作業手順書の作成にあたった。また、新たな無血清培地を作成し、増幅される細胞の評価を行なった。
I. GMPに準拠した培養システムの開発とCell processingの基盤整備
医薬品GMPにおいては、「薬局等構造設備規則」により製造を行う設備の規定などが詳細に規格化されている。一方生物製剤においては、安全に細胞を加工するためのセルプロセッシングセンターの規格化は未だ行なわれていないのが現状である。本研究においては、セルプロセッシングセンターでの培養操作に関する研究を行ない、安全な細胞製剤を作成するための科学的な基準をつくることを目的にハード、ソフトの規格、検証を行った。特に大学などの研究機関で行なういわゆるInstitutinal GMPの具体的な基準づくりを目指した。一方で安全に細胞をプロセッシングするためのデバイスの開発として、培養バッグ、無菌閉鎖系細胞洗浄装置、CO2 インキュベータを開発し、実際の細胞を用いて評価を行なった。
II. 加工細胞の品質管理法の確立
加工細胞の品質および安全性を保証する指針としては、「ヒト又は動物由来成分を原料として製造される医薬品等の品質及び安全性確保について」(医薬発第1314号、厚生省医薬安全局長通知)に必要な品質管理法の概要が示されており、我々はこれに従い安全性の検討を本研究において行なった。
効果の予測、及び安全性確保のための試験として、NOD/SCIDマウスおよびNOGマウスを用いた移植実験を行なった。
IV.新GCPに準拠した臨床プロトコルの作成
細胞治療はオーダーメイド治療が中心となるため、効果および副作用の個体差が大きく、未だその評価を正確に行なう臨床プロトコルの構築は研究途上であるといえる。
これまでの海外でのEx vivo増幅臍帯血を用いた臨床研究について、増幅に用いられている培養法を追試し、細胞形態、分化能、及び自己複製能などin vitroでの比較を行なうことで、その効果と安全性の検討を行なった。
V臍帯血造血幹細胞の自己複製能、分化能の機序の解明
造血幹細胞の自己複製因子であるHOX転写因子群とその調節因子であるPBX1との複合体は、造血幹細胞の増殖、分化に関する種々の遺伝子の発現を調節することが報告されている。本研究において内因性のHOX/PBX1複合体の活性を変化させ得るHOXタンパクのdecoyペプチドを設計、合成し、decoyペプチドが造血幹細胞の自己複製能や多分化能に及ぼす影響について検討を行なった。
平成14年7月に薬事法が改正され、細胞治療製剤が定義されるとともにGTPに準拠した製造を義務づけられた。本研究ではより安全な培養を行なうため、無血清培養法の開発、培養原材料の検討、効果的な細胞融解法、分離法の検討、閉鎖系培養システムの構築などの開発を行った。
平成14年度の成果から培養に用いる培地、試薬の選択、サイトカインの至適濃度の決定は終了した。本年度は臍帯血バンクに凍結してある臍帯血を用いた細胞の解凍法の検討、Clinical gradeでのCD34陽性細胞の分離法の確立、バッグ培養による閉鎖系培養法の確立を行ない、臨床試験に備えた培養法の通し運転を行なうことにより標準作業手順書の作成にあたった。また、新たな無血清培地を作成し、増幅される細胞の評価を行なった。
I. GMPに準拠した培養システムの開発とCell processingの基盤整備
医薬品GMPにおいては、「薬局等構造設備規則」により製造を行う設備の規定などが詳細に規格化されている。一方生物製剤においては、安全に細胞を加工するためのセルプロセッシングセンターの規格化は未だ行なわれていないのが現状である。本研究においては、セルプロセッシングセンターでの培養操作に関する研究を行ない、安全な細胞製剤を作成するための科学的な基準をつくることを目的にハード、ソフトの規格、検証を行った。特に大学などの研究機関で行なういわゆるInstitutinal GMPの具体的な基準づくりを目指した。一方で安全に細胞をプロセッシングするためのデバイスの開発として、培養バッグ、無菌閉鎖系細胞洗浄装置、CO2 インキュベータを開発し、実際の細胞を用いて評価を行なった。
II. 加工細胞の品質管理法の確立
加工細胞の品質および安全性を保証する指針としては、「ヒト又は動物由来成分を原料として製造される医薬品等の品質及び安全性確保について」(医薬発第1314号、厚生省医薬安全局長通知)に必要な品質管理法の概要が示されており、我々はこれに従い安全性の検討を本研究において行なった。
効果の予測、及び安全性確保のための試験として、NOD/SCIDマウスおよびNOGマウスを用いた移植実験を行なった。
IV.新GCPに準拠した臨床プロトコルの作成
細胞治療はオーダーメイド治療が中心となるため、効果および副作用の個体差が大きく、未だその評価を正確に行なう臨床プロトコルの構築は研究途上であるといえる。
これまでの海外でのEx vivo増幅臍帯血を用いた臨床研究について、増幅に用いられている培養法を追試し、細胞形態、分化能、及び自己複製能などin vitroでの比較を行なうことで、その効果と安全性の検討を行なった。
V臍帯血造血幹細胞の自己複製能、分化能の機序の解明
造血幹細胞の自己複製因子であるHOX転写因子群とその調節因子であるPBX1との複合体は、造血幹細胞の増殖、分化に関する種々の遺伝子の発現を調節することが報告されている。本研究において内因性のHOX/PBX1複合体の活性を変化させ得るHOXタンパクのdecoyペプチドを設計、合成し、decoyペプチドが造血幹細胞の自己複製能や多分化能に及ぼす影響について検討を行なった。
結果と考察
研究結果=I. GMPに準拠した培養法の確立
臍帯血バンクで凍結された保存臍帯血を用いてサイトカインによる増幅培養法を検討した結果、 12日間で総細胞数100倍、CD34陽性細胞30倍増幅させる技術を確立した。無血清培地の開発では、リコンビナントアルブミン、コレステロール、燐脂質、各種ビタミンを配合することにより、造血幹細胞を未分化のまま増幅できる培地を開発した。
II. GMPに準拠した培養システムの開発とCell processingの基盤整備
GMPに準拠したCell processingの基盤整備においては、先端医療センター、京都大学内にセルプロセッシングセンターを完成させたことに加え、安全な細胞を製造するための環境衛生基準書を作成した。
培養バッグの開発はバッグの素材により造血幹細胞の増幅効率やCD34の発現に差が出ることを確認した。
無菌細胞洗浄装置は実際に培養した活性化リンパ球や造血幹細胞を洗浄し、最終製剤であるアルブミン添加生理食塩水に置き換える系を確立し、細胞のロスや細胞機能を損ねることなく、効率よくサイトカインや培養液を除去できることを確認した。
取り違え防止CO2インキュベータは電磁ロック式で多段扉型の機械を試作し、バーコード管理にて細胞操作と連動し、ロックを解除させるシステムを構築した。
III加工細胞の品質管理法の確立
サイトカインで増幅させた臍帯血の形態、表面抗原、サイトカイン産生能、染色体の数異常、転座などの構造異常、コロニー形成能を検討した。またヒト由来細胞であるため、安全に細胞培養を行なうためにはウイルス否定試験は不可欠であり、短時間に少量の検体で結果の得られるmultiplex PCR法を開発した。in vivoでの増幅培養細胞の評価としては、NOD/SCIDマウスを用いて生着能の評価の他、体内分布、炎症、変性、腫瘍化の有無など安全性の評価を行なった。またNOD/SCIDマウスにcommon γchainの変異を導入し、NOD/SCID/γc nullマウス(NOGマウス)を作成し、ヒト造血幹細胞の活性測定の系を確立した。このマウスでは従来評価できなかったT cell系のヒト細胞の生着が認められ、移植後の免疫能の評価が可能になった。
VI新GCPに準拠した臨床プロトコルの作成
in vitroでの造血能の評価、品質の比較、及びNOD/SCIDマウスへの移植系の比較から、本法はすでに行なわれている他の体外増幅法と同等以上の効果と安全性は示せたと考え、臨床プロトコルの作成に着手した。
VII.臍帯血造血幹細胞の自己複製能、分化能の機序の解明
in vitro及びin vivoでの解析の結果、HOXタンパクのdecoyペプチドは造血幹細胞の自己複製を亢進させる作用を有すると推測された。
臍帯血バンクで凍結された保存臍帯血を用いてサイトカインによる増幅培養法を検討した結果、 12日間で総細胞数100倍、CD34陽性細胞30倍増幅させる技術を確立した。無血清培地の開発では、リコンビナントアルブミン、コレステロール、燐脂質、各種ビタミンを配合することにより、造血幹細胞を未分化のまま増幅できる培地を開発した。
II. GMPに準拠した培養システムの開発とCell processingの基盤整備
GMPに準拠したCell processingの基盤整備においては、先端医療センター、京都大学内にセルプロセッシングセンターを完成させたことに加え、安全な細胞を製造するための環境衛生基準書を作成した。
培養バッグの開発はバッグの素材により造血幹細胞の増幅効率やCD34の発現に差が出ることを確認した。
無菌細胞洗浄装置は実際に培養した活性化リンパ球や造血幹細胞を洗浄し、最終製剤であるアルブミン添加生理食塩水に置き換える系を確立し、細胞のロスや細胞機能を損ねることなく、効率よくサイトカインや培養液を除去できることを確認した。
取り違え防止CO2インキュベータは電磁ロック式で多段扉型の機械を試作し、バーコード管理にて細胞操作と連動し、ロックを解除させるシステムを構築した。
III加工細胞の品質管理法の確立
サイトカインで増幅させた臍帯血の形態、表面抗原、サイトカイン産生能、染色体の数異常、転座などの構造異常、コロニー形成能を検討した。またヒト由来細胞であるため、安全に細胞培養を行なうためにはウイルス否定試験は不可欠であり、短時間に少量の検体で結果の得られるmultiplex PCR法を開発した。in vivoでの増幅培養細胞の評価としては、NOD/SCIDマウスを用いて生着能の評価の他、体内分布、炎症、変性、腫瘍化の有無など安全性の評価を行なった。またNOD/SCIDマウスにcommon γchainの変異を導入し、NOD/SCID/γc nullマウス(NOGマウス)を作成し、ヒト造血幹細胞の活性測定の系を確立した。このマウスでは従来評価できなかったT cell系のヒト細胞の生着が認められ、移植後の免疫能の評価が可能になった。
VI新GCPに準拠した臨床プロトコルの作成
in vitroでの造血能の評価、品質の比較、及びNOD/SCIDマウスへの移植系の比較から、本法はすでに行なわれている他の体外増幅法と同等以上の効果と安全性は示せたと考え、臨床プロトコルの作成に着手した。
VII.臍帯血造血幹細胞の自己複製能、分化能の機序の解明
in vitro及びin vivoでの解析の結果、HOXタンパクのdecoyペプチドは造血幹細胞の自己複製を亢進させる作用を有すると推測された。
結論
細胞治療および再生医療の実現のためには、本プロジェクトの分担研究で示したような様々な基盤整備が必要である。特に細胞治療製剤は生き物であるため、できるだけ品質や細胞が均一になるよう培養の規格を設けなければ、効果の科学的検証や臨床試験の科学性は保たれない。
本年度の研究成果本年度の研究成果から、このような規格の整備や臨床試験を行なうために必要な安全性の検証は行なえたと考えられる。
平成16年度はこれらの成果をもとに実際の臨床試験を計画し、増幅臍帯血による移植の有用性を示す予定である。
本年度の研究成果本年度の研究成果から、このような規格の整備や臨床試験を行なうために必要な安全性の検証は行なえたと考えられる。
平成16年度はこれらの成果をもとに実際の臨床試験を計画し、増幅臍帯血による移植の有用性を示す予定である。
公開日・更新日
公開日
-
更新日
-