文献情報
文献番号
200300560A
報告書区分
総括
研究課題名
HIV感染予防に関する研究(総括研究報告書)
課題番号
-
研究年度
平成15(2003)年度
研究代表者(所属機関)
佐多 徹太郎(国立感染症研究所)
研究分担者(所属機関)
- 俣野哲朗(東京大学大学院医学系研究科)
- 三浦智行(京都大学ウイルス研究所)
- 本多三男(国立感染症研究所エイズ研究センター)
- 森 一泰(国立感染症研究所エイズ研究センター)
- 庄司省三(熊本大学大学院)
- 向井鐐三郎(国立感染症研究所筑波霊長類センター)
- 保富康宏(三重大学医学部)
- 神奈木真理(東京医科歯科大学大学院)
- 牧野正彦(国立感染症研究所ハンセン病研究センター)
- 横田恭子(国立感染症研究所免疫部)
- 横幕能行(千葉大学医学部附属病院)
- 中島典子(国立感染症研究所感染病理部)
- 高橋秀実(日本医科大学医学部)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 先端的厚生科学研究分野 エイズ対策研究
研究開始年度
平成15(2003)年度
研究終了予定年度
平成17(2005)年度
研究費
117,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
HAARTの開発によりHIV感染者の予後は改善されたが、コンプライアンスやコストそして薬剤耐性などの問題があるため、エイズ克服にはHIV感染の予防に優るものはなく、なかでもワクチン開発が最重要課題である。一方で防御免疫機構やいまだ明らかではないHIV感染病態の解明はワクチン開発のみならずHIV感染予防にとっても重要な課題である。本研究班ではわが国のサルを用いたエイズワクチン研究者やHIV感染防御免疫機構やHIV感染病態研究者によるHIV感染予防を目的とし研究を推進することにより、ヒトでの実用化に耐えるワクチン開発研究を行うことを目的とする。
研究方法
(サルを用いた有効かつ安全なワクチン開発)DNA/SeV-(SIVmac239)Gagプライムブーストワクチン接種サルにSIVチャレンジ実験を行い、防御効果および誘導免疫およびCTLエピトープを解析する(俣野)。タイ型ワクチン投与サルにおける細胞性及び液性免疫の確認と防御免疫に最小必要量の検討を行う(本多)。弱毒生ワクチン株のサルにおける安全性の確認実験、各種サイトカイン挿入SHIVやHIV-1Envの糖鎖欠損SHIVおよび半生DNAワクチンの改良による感染性・免疫誘導能・感染防御能について調べる(三浦)。Env vaccineをもとにその他の遺伝子を加えたワクチン、d-5Gをtemplateとした糖鎖欠失変異ウイルスおよび抗原性の異なるチャレンジウイルスを作成し、効果を検討した(森)。HIV-1 coreceptorの特殊立体構造peptideの構築と単クローン抗体の作出そして抗HIV活性やケモタキシス活性を調べるとともにサルへの免疫を行う(庄司)。サル由来細胞にSIVcm株を感染させ増殖細胞を同定し、抗原となる細胞株を探索する (向井)。(ワクチン免疫による防御機構の解明)アジュバント開発としてα抗原遺伝子とエイズウイルスDNAワクチンをマウスに混合接種し抗体産生やCTL誘導能を検討する (保富)。HIV-1抑制シグナルを伝えるCD4陽性T細胞上の表面分子を検索し、これを介したHIV-1抑制機序を解明する(神奈木)。DC-SIGN発現をHIVおよび抗酸菌のリガンドを用いてブロックしたとき病原体の樹状細胞内侵入に及ぼす影響をFACSで検討する(牧野)。種々のHIVのワクチン候補を用いて樹状細胞とT細胞の相互作用を阻害あるいは修飾するT細胞の活性化能や誘導サイトカイン等を細胞レベルおよびDNAアレイで解析する (横田)。CTL逃避機構の解明を目的として多くの臨床検体由来のgag-polを組込むHIV-1ベクターを用いて標的細胞を作製する (横幕)。(いまだ明らかとなっていないHIV感染病態の解析)HGV全長DNAクローンを作製し、またHIV感染者でのHGVの存在を調べ、HGVによるエイズ発症遅延機構を解明する(佐多)。HIV脳炎の病態解明を目的としin vitroで分化させたサルの神経幹細胞培養系のSIVないしSHIVに対する感受性評価および神経幹細胞への感染性に影響を及ぼす因子を解析する (中島)。HIV感染防御に関与する小腸上皮内リンパ球(IEL)の役割を検討する目的でCTL-TCR発現遺伝子改変マウスの粘膜組織におけるTCR発現細胞を解明し、TCRの認識抗原発現組み換えワクチニアウイルスの接種によるTCR発現細胞の動態を探る (高橋)。
結果と考察
(サルを用いた有効かつ安全な
ワクチン開発)ワクチン接種後のチャレンジ実験では、8頭中5頭においてSIV複製制御が認められた。これら5頭と感染制御が認められなかった3頭の間では、末梢血中Gag特異的CTLレベルには有意差はなかった。しかし、チャレンジ後5週目の血漿由来SIV genomeの gag領域塩基配列の解析では、前者5頭においてのみ、各々1つのCTLエスケープ変異が dominantとなっており、そのエピトープ特異的CTLがwild-type SIVの迅速な排除に中心的役割を果たしたことが明らかとなった(俣野)。HIV-1 CRF01_AE Gag遺伝子を組込んだ組換えBCGワクチンと組換えDIsワクチンを作成し検討したところ、ヒトへの投与可能量0.1mg BCGと107pfu DIsで抗原特異的γインターフェロンT細胞の数が400～600 ELISpot検出された。DIsウイルスベクターはほ乳類細胞では増殖しないが外来性遺伝子の発現は充分に行えることを明らかにした(本多)。生ワクチン元株をサルで5代個体継代行ったが強毒化しなかった。nef欠失弱毒SHIV接種によりワクチン接種後4週で強毒SHIV攻撃接種に対してある程度の防御効果が誘導されていた。nef欠失部位へのインターフェロンγ遺伝子組込みにより、攻撃接種ウイルスに対して増殖抑制ないし増幅の両面が明らかとなった。インターロイキン2遺伝子を挿入したSHIV半生DNAワクチンは強毒SHIV攻撃接種に対してある程度の感染防御効果があることを示した(三浦)。アカゲザル4頭にSIVmac239 Envまたは5本の糖鎖を欠くd5G-Env を抗原としてDNAワクチンによるprime免疫、組み換えvacciniaによるboost免疫をおこない、8週後、各2頭にSIVmac239とd-5Gを静脈内接種した。初期感染のピークはSIVmac239感染では非免疫ザル感染に比べで約1/10低下し、d-5G感染では1/10-1/100に低下したが、抑制効果の差はみられなかった。set pointにおける抑制効果についてはSIVmac239感染に対して、Wt-Envワクチン群はviral loadが1/10低かったが、d-5G感染に対しては両ワクチン群に差はみられなかった(森)。HIV-1 coreceptor CCR5の特殊立体構造をミミックしたcDDR5-MAPを調製し、カニクイサルで抗体誘導活性を検討した。cDDR5-MAP抗原は細胞表面のnative CCR5を認識する特殊抗体を誘導し、さらにnon-clade B HIV-1 R5ウイルス対しても感染防止効果を示すことが明らかになった(庄司)。サルエイズ脳炎脳組織から樹立したモノサイト系 SIV産生細胞株2株(CM1,CM5)由来のウイルスは、サル骨髄細胞に感染させるとCM様細胞のコロニーが形成され、分裂増殖し、培養上清中にSIVcmの産生が確認された(向井)。(ワクチン免疫による防御機構の解明)DNA導入によりHIVenv抗原とα抗原の発現は同一組織にみられた。α抗原添加群ではIL-4産生が低下しIFN-γが増加を示し、またCTLが誘導され、BCGの感作でより明らかとなった。免疫マウスにHIVenv組み込みワクシニアウイルスを接種したところ、α抗原遺伝子添加、BCG感作群でウイルスをコントロールしていることが示され、その接種時の脾細胞はHIVenv特異的に高い細胞傷害活性を示した(保富)。HIV-1抑制シグナルを伝えるCD4陽性T細胞上の表面分子として、CD28ファミリー分子として知られているCD28, CTLA-4, ICOS, PD1について解析を行った。ヒトCD28とICOSに対するモノクローナル抗体がR5あるいはX4 HIV-1株の急性感染に引き続くウイルス産生を有意に抑制し、細胞増殖抑制や細胞毒性を示さなかった(神奈木)。DC-SIGN変異発現細胞株を樹立しGFP標識BCG菌を感染させると感染し、細胞内ライソゾームまで侵入していた。末梢血由来のDCをBCG菌で刺激すると活性化した。またらい菌でパルスすると自己のT細胞を活性化した。菌膜に存在するMMP-IIとDC-SIGNが結合することが示唆された(牧野)。樹状細胞を成熟化させる活性を有するYeast VLPとウイルスベクターを組み合わせることにより、T細胞のin vitroでプライミングが可能であることが明らかとなった(横田)。臨床検体由来gag-polを効率よく感染性クローンにクローン化する方法を確立し、実際にタイ流行株を6クローン樹立した(横幕)。(いまだ明らかとなっていないHIV感染病態の解析)HGVのエイズ発症遅延機構を調べるためHGV
の感染性クローンの作製を行ったが、ゲノムは検出できたが蛋白レベルでの発現はみられなかった(佐多)。HIV脳症の動物モデルであるSIV脳症の病態を解析できるin vitroの培養系をサル胎児脳由来の神経幹細胞を用いて確立した。マクロファージ向性SIVの中でもSIV17E/Frの感染性が最も高く、EGFP遺伝子を挿入したクローンを感染させるとGFP陽性細胞はIV p27抗原陽性で経時的に増加した。アストロサイトのほか、ニューロンでもGFP陽性細胞が認められた(中島)。H-2Dd/P18-I10テトラマーを用いて、特異的CTLを発現した細胞数を解析したところ、未免疫Tg-RT1の脾臓や腸管膜リンパ節(MLN)におけるT細胞は全てαβ型TCR を発現しているのに対し、粘膜免疫を反映するIELはCD8ααとCD8αβ型双方からなるαβTCR T 細胞とCD8αα型γδTCR 発現T 細胞によって構成されることが判明した(高橋)。
ワクチン開発)ワクチン接種後のチャレンジ実験では、8頭中5頭においてSIV複製制御が認められた。これら5頭と感染制御が認められなかった3頭の間では、末梢血中Gag特異的CTLレベルには有意差はなかった。しかし、チャレンジ後5週目の血漿由来SIV genomeの gag領域塩基配列の解析では、前者5頭においてのみ、各々1つのCTLエスケープ変異が dominantとなっており、そのエピトープ特異的CTLがwild-type SIVの迅速な排除に中心的役割を果たしたことが明らかとなった(俣野)。HIV-1 CRF01_AE Gag遺伝子を組込んだ組換えBCGワクチンと組換えDIsワクチンを作成し検討したところ、ヒトへの投与可能量0.1mg BCGと107pfu DIsで抗原特異的γインターフェロンT細胞の数が400～600 ELISpot検出された。DIsウイルスベクターはほ乳類細胞では増殖しないが外来性遺伝子の発現は充分に行えることを明らかにした(本多)。生ワクチン元株をサルで5代個体継代行ったが強毒化しなかった。nef欠失弱毒SHIV接種によりワクチン接種後4週で強毒SHIV攻撃接種に対してある程度の防御効果が誘導されていた。nef欠失部位へのインターフェロンγ遺伝子組込みにより、攻撃接種ウイルスに対して増殖抑制ないし増幅の両面が明らかとなった。インターロイキン2遺伝子を挿入したSHIV半生DNAワクチンは強毒SHIV攻撃接種に対してある程度の感染防御効果があることを示した(三浦)。アカゲザル4頭にSIVmac239 Envまたは5本の糖鎖を欠くd5G-Env を抗原としてDNAワクチンによるprime免疫、組み換えvacciniaによるboost免疫をおこない、8週後、各2頭にSIVmac239とd-5Gを静脈内接種した。初期感染のピークはSIVmac239感染では非免疫ザル感染に比べで約1/10低下し、d-5G感染では1/10-1/100に低下したが、抑制効果の差はみられなかった。set pointにおける抑制効果についてはSIVmac239感染に対して、Wt-Envワクチン群はviral loadが1/10低かったが、d-5G感染に対しては両ワクチン群に差はみられなかった(森)。HIV-1 coreceptor CCR5の特殊立体構造をミミックしたcDDR5-MAPを調製し、カニクイサルで抗体誘導活性を検討した。cDDR5-MAP抗原は細胞表面のnative CCR5を認識する特殊抗体を誘導し、さらにnon-clade B HIV-1 R5ウイルス対しても感染防止効果を示すことが明らかになった(庄司)。サルエイズ脳炎脳組織から樹立したモノサイト系 SIV産生細胞株2株(CM1,CM5)由来のウイルスは、サル骨髄細胞に感染させるとCM様細胞のコロニーが形成され、分裂増殖し、培養上清中にSIVcmの産生が確認された(向井)。(ワクチン免疫による防御機構の解明)DNA導入によりHIVenv抗原とα抗原の発現は同一組織にみられた。α抗原添加群ではIL-4産生が低下しIFN-γが増加を示し、またCTLが誘導され、BCGの感作でより明らかとなった。免疫マウスにHIVenv組み込みワクシニアウイルスを接種したところ、α抗原遺伝子添加、BCG感作群でウイルスをコントロールしていることが示され、その接種時の脾細胞はHIVenv特異的に高い細胞傷害活性を示した(保富)。HIV-1抑制シグナルを伝えるCD4陽性T細胞上の表面分子として、CD28ファミリー分子として知られているCD28, CTLA-4, ICOS, PD1について解析を行った。ヒトCD28とICOSに対するモノクローナル抗体がR5あるいはX4 HIV-1株の急性感染に引き続くウイルス産生を有意に抑制し、細胞増殖抑制や細胞毒性を示さなかった(神奈木)。DC-SIGN変異発現細胞株を樹立しGFP標識BCG菌を感染させると感染し、細胞内ライソゾームまで侵入していた。末梢血由来のDCをBCG菌で刺激すると活性化した。またらい菌でパルスすると自己のT細胞を活性化した。菌膜に存在するMMP-IIとDC-SIGNが結合することが示唆された(牧野)。樹状細胞を成熟化させる活性を有するYeast VLPとウイルスベクターを組み合わせることにより、T細胞のin vitroでプライミングが可能であることが明らかとなった(横田)。臨床検体由来gag-polを効率よく感染性クローンにクローン化する方法を確立し、実際にタイ流行株を6クローン樹立した(横幕)。(いまだ明らかとなっていないHIV感染病態の解析)HGVのエイズ発症遅延機構を調べるためHGV
の感染性クローンの作製を行ったが、ゲノムは検出できたが蛋白レベルでの発現はみられなかった(佐多)。HIV脳症の動物モデルであるSIV脳症の病態を解析できるin vitroの培養系をサル胎児脳由来の神経幹細胞を用いて確立した。マクロファージ向性SIVの中でもSIV17E/Frの感染性が最も高く、EGFP遺伝子を挿入したクローンを感染させるとGFP陽性細胞はIV p27抗原陽性で経時的に増加した。アストロサイトのほか、ニューロンでもGFP陽性細胞が認められた(中島)。H-2Dd/P18-I10テトラマーを用いて、特異的CTLを発現した細胞数を解析したところ、未免疫Tg-RT1の脾臓や腸管膜リンパ節(MLN)におけるT細胞は全てαβ型TCR を発現しているのに対し、粘膜免疫を反映するIELはCD8ααとCD8αβ型双方からなるαβTCR T 細胞とCD8αα型γδTCR 発現T 細胞によって構成されることが判明した(高橋)。
結論
ほぼ想定した研究結果が得られたので、来年度の成果が期待される。
公開日・更新日
公開日
-
更新日
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