文献情報
文献番号
200300410A
報告書区分
総括
研究課題名
幹細胞と形態形成遺伝子を用いた眼組織の再生と修復に関する研究
課題番号
-
研究年度
平成15(2003)年度
研究代表者(所属機関)
東 範行(国立成育医療センター眼科)
研究分担者(所属機関)
- 奥山虎之(国立成育医療センター遺伝診療科)
- 片岡浩介(東京工業大学フロンティア創造共同研究センター)
- 根岸一乃(慶應義塾大学眼科)
- 田中靖彦(国立病院東京医療センター)
- 仁科博史(東京大学大学院薬学系研究科)
- 渡邊卓(杏林大学医学部臨床病理学教室)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 総合的プロジェクト研究分野 ヒトゲノム・再生医療等研究（再生医療分野）
研究開始年度
平成13(2001)年度
研究終了予定年度
平成16(2004)年度
研究費
24,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
視覚器の構造はきわめて複雑であるが、近年いくつもの形態形成遺伝子が発見されるにおよび、その形成システムの解明は急速な展開を見せている。ことに、Pax6は眼形成のmaster control遺伝子であると考えられており、ショウジョウバエやアフリカツメガエルではtarget expressionによって異所性に眼を形成することができ、下等動物であれば眼全体を作るほど強力な機能をもっている。この遺伝子はヒトでも発生を通じて眼のほぼすべての組織に発現しており、疾患の遺伝子変異検索では先天無虹彩、前眼部形成異常、先天白内障、黄斑低形成、視神経形成異常などでPax6の変異が見つかっていることから、ヒトでも眼の形態形成で多彩な機能を担っていると考えられる。下等動物であればPax6遺伝子だけで眼全体を作ることができるが、高等動物では困難である。しかし、網膜などの部分的な組織を作ることは期待でき、失われた視覚を回復する治療に通ずると考えられる。
眼の形態形成では、Pax6を頂点として多くの遺伝子がカスケードを形成しているが、最近Pax6の下流で働く遺伝子(Eya、SO、Dac等)が発見され機能が解析されている。これらはPax6に次ぐ準master control遺伝子であると考えられ、これらを用いても組織を再生させることが期待される。さらに、最近Pax6の下流で水晶体形成を担う遺伝子L-Mafが発見された。これらの形態形成遺伝子は、網膜や水晶体を含めて眼のさまざまな組織を再生させる鍵になると考えられる。
再生において、もう1つの重要な要素は幹細胞である。両生類では網膜色素上皮細胞から神経網膜と水晶体が再生されるので、網膜と虹彩毛様体色素上皮細胞が注目されている。我々が色素上皮細胞にPax6を導入して網膜を形成したことから、網膜再生においては色素上皮細胞が幹細胞として期待される。水晶体では、L-Mafを導入して幼若な皮膚を水晶体へ分化転換することができるが、白内障手術などで残存する水晶体上皮細胞も1つの候補である。
初年度は、角膜の修復に関しては、ムコ多糖症の混濁に対する遺伝子治療を行った。水晶体の再生に関して形成遺伝子L-Mafのヒトとマウスのホモログを同定し、白内障術後の残存水晶体上皮細胞に幹細胞としての可能性があるかを検討した。また、網膜の再生では、網膜特異遺伝子の同定、転写因子の発現誘導や細胞の増殖・分化に関わる細胞内シグナルの働き、脳由来神経幹細胞あるいは網膜色素上皮細胞からの神経網膜分化、誘導に関する研究を行った。
2年度は、Cre-loxPシステムと組織特異的遺伝子のプロモーターを用いて、複雑な構造をもつ眼の組織において選択した組織に遺伝子を導入させる方法を開発した。これを用いて白内障手術後の水晶体細胞増殖予防を行った。角膜においては創傷治癒に関係する遺伝子の検索をヒトcDNAアレーを用いて行った。水晶体においては、レンズ細胞に特異的な転写因子MafA/L-Mafの発現と機能を解析した。網膜では、眼形成転写因子PAX6を薬剤の除去(Tet-off)によって誘導可能なマウス胚性幹(ES)細胞を樹立し、MAPキナーゼファミリーの機能を検討し、これらを用いる網膜細胞ペレット培養法を作成した。さらに、Pax6のexon 5aをもつisoformの機能を解析した。
本年度は、角膜の修復に関しては、ムコ多糖症の混濁に対する胎児遺伝子治療を行った。水晶体においては、Cre-loxPシステムとアポト-シス遺伝子のプロモーターを用いて、白内障手術後の水晶体細胞増殖予防を行った。またレンズ細胞特異的転写因子MafA/L-Mafの発現と機能を解析した。網膜では、網膜特異的銅依存性アミン酸化酵素(AOC2)の機能解析を行った。ES細胞の生存維持にはERK系が、分化誘導に伴う遺伝子発現にはSAPK/JNK系が関与することを見い出した。また、PAX6遺伝子をマウス胎児の色素上皮に導入することによって、網膜組織へと分化誘導する可能であることを見い出した。ES細胞のはin vitroで発生期網膜細胞と混合培養すると、神経系細胞へと分化することが明らかとなった。さらにシグナル伝達物質ShhがPax6を制御して網膜の分化を決定している証拠を得た。顔面で発現するShhがPax6の発現に影響を及ぼし、網膜の分化や眼球の形態、ひいては黄斑の位置付けや視線を決定していることが示唆された。
眼の形態形成では、Pax6を頂点として多くの遺伝子がカスケードを形成しているが、最近Pax6の下流で働く遺伝子(Eya、SO、Dac等)が発見され機能が解析されている。これらはPax6に次ぐ準master control遺伝子であると考えられ、これらを用いても組織を再生させることが期待される。さらに、最近Pax6の下流で水晶体形成を担う遺伝子L-Mafが発見された。これらの形態形成遺伝子は、網膜や水晶体を含めて眼のさまざまな組織を再生させる鍵になると考えられる。
再生において、もう1つの重要な要素は幹細胞である。両生類では網膜色素上皮細胞から神経網膜と水晶体が再生されるので、網膜と虹彩毛様体色素上皮細胞が注目されている。我々が色素上皮細胞にPax6を導入して網膜を形成したことから、網膜再生においては色素上皮細胞が幹細胞として期待される。水晶体では、L-Mafを導入して幼若な皮膚を水晶体へ分化転換することができるが、白内障手術などで残存する水晶体上皮細胞も1つの候補である。
初年度は、角膜の修復に関しては、ムコ多糖症の混濁に対する遺伝子治療を行った。水晶体の再生に関して形成遺伝子L-Mafのヒトとマウスのホモログを同定し、白内障術後の残存水晶体上皮細胞に幹細胞としての可能性があるかを検討した。また、網膜の再生では、網膜特異遺伝子の同定、転写因子の発現誘導や細胞の増殖・分化に関わる細胞内シグナルの働き、脳由来神経幹細胞あるいは網膜色素上皮細胞からの神経網膜分化、誘導に関する研究を行った。
2年度は、Cre-loxPシステムと組織特異的遺伝子のプロモーターを用いて、複雑な構造をもつ眼の組織において選択した組織に遺伝子を導入させる方法を開発した。これを用いて白内障手術後の水晶体細胞増殖予防を行った。角膜においては創傷治癒に関係する遺伝子の検索をヒトcDNAアレーを用いて行った。水晶体においては、レンズ細胞に特異的な転写因子MafA/L-Mafの発現と機能を解析した。網膜では、眼形成転写因子PAX6を薬剤の除去(Tet-off)によって誘導可能なマウス胚性幹(ES)細胞を樹立し、MAPキナーゼファミリーの機能を検討し、これらを用いる網膜細胞ペレット培養法を作成した。さらに、Pax6のexon 5aをもつisoformの機能を解析した。
本年度は、角膜の修復に関しては、ムコ多糖症の混濁に対する胎児遺伝子治療を行った。水晶体においては、Cre-loxPシステムとアポト-シス遺伝子のプロモーターを用いて、白内障手術後の水晶体細胞増殖予防を行った。またレンズ細胞特異的転写因子MafA/L-Mafの発現と機能を解析した。網膜では、網膜特異的銅依存性アミン酸化酵素(AOC2)の機能解析を行った。ES細胞の生存維持にはERK系が、分化誘導に伴う遺伝子発現にはSAPK/JNK系が関与することを見い出した。また、PAX6遺伝子をマウス胎児の色素上皮に導入することによって、網膜組織へと分化誘導する可能であることを見い出した。ES細胞のはin vitroで発生期網膜細胞と混合培養すると、神経系細胞へと分化することが明らかとなった。さらにシグナル伝達物質ShhがPax6を制御して網膜の分化を決定している証拠を得た。顔面で発現するShhがPax6の発現に影響を及ぼし、網膜の分化や眼球の形態、ひいては黄斑の位置付けや視線を決定していることが示唆された。
研究方法
1)新生仔ムコ多糖症角膜混濁の遺伝子治療:ヒトβ-グルクロニダーゼ遺伝子を発現するアデノウイルスベクターAxCAGUS を作成し、このウイルスベクターAxCAGUS 1X107 pfuを生後24時間以内の新生仔ムコ多糖症VII型マウスの浅側頭静脈から全身投与した。投与30日後に眼球を摘出し、導入遺伝子発現を調べるため角膜および網膜のβ-グルクロニダーゼ活性染色を行った。また治療効果を検討するため治療群と無治療群のムコ多糖症VII型マウスの角膜および網膜の組織病理所見について比較検討した。2)Cre/lox Pシステムを用いたcaspase 8導入による水晶体上皮細胞増殖の抑制:Cre/lox P 系・アデノウイルスベクターを用いたFasリガンド導入により白色家兎水晶体吸引術後の水晶体上皮細胞増殖の抑制について検討した。白色家兎に対する水晶体吸引術後、Cre/loxP系によりCAGプロモーターを用いてcaspase 8遺伝子を導入した。また水晶体に特異的なα1クリスタリンプロモーターを用いてcaspase 8を導入した。LacZ染色あるいはTUNEL法によって発現を確認した。3)レンズ細胞特異的転写因子MafA/L-Maf:L-mafホモログは膵島β細胞に特異的に発現していたので、β細胞株を用いてその転写活性化能、活性制御機構などを生化学的に調べた。4)網膜特異的銅依存性アミン酸化酵素(AOC2)の機能解析:ヒトAOC2のcDNAをプローブとしてマウス及びラットのcDNA及び遺伝子をクローニングして全塩基配列を決定した。さらに周辺の遺伝子をクローニングしてシークエンスした結果とCELERA社のゲノムデーターベースによる解析を行った。タンパク質構造解析プログラムLOOKを用いて、AOC2と類似する大腸菌銅依存性アミン酸化酵素の結晶構造からAOC2、AOC3の構造推測を行う。免疫染色等の方法によってAOC2が膜タンパク質であることを証明した。5)幹細胞から眼組織への分化に関する研究:阻害剤や遺伝子破壊法を用いてマウスES細胞におけるMAPキナーゼ系の役割を検討した。また、ヒト眼疾患関連遺伝子として見出されたPAX6をマウス胎児の色素上皮に導入し、新たに網膜が構築されるか否かを検討した。6)幹細胞から網膜細胞への分化誘導に関する研究:マウスES細胞を網膜の細胞環境に置くことにより網膜細胞への分化誘導が可能であるか否かを検討するため、発生期網膜内への幹細胞の直接的な移植を試みるとともに,発生期ラット網膜のpellet培養系を応用した混合培養を行った。いずれの場合にも、幹細胞を識別する目的でレトロビールスを用いて幹細胞にGFP遺伝子を組み込んだ上でこれを用い,また網膜細胞への分化の指標として、網膜の光受容体細胞に固有なロドプシンに対する抗体を用いた。移植実験では,胎生11?13日マウス胎仔の硝子体下腔に細胞を注入した。pellet培養での混合実験では、GFP陽性神経幹細胞を発生期網膜細胞と少なくとも2週間混合培養した後、GFP陽性細胞に関して、ロドプシン等の発現の状況を検討した。7)細胞外シグナル伝達物質Shhの網膜形成への役割: Holoprosencephalyの軽症例でShhの変異を検討した。P19細胞を用いて、Shh-WTと今回見つけた変異体を量依存的にP19細胞で
強制発現させ、内因性Pax6の発現をRT-PCRで検討した。Shhのgain-of-function in vivo実験として、鶏2-7日胚の眼球外間葉組織にShh遺伝子を電気穿孔法で導入し病理変化を検討した。Shhのloss-of-function実験として、同じく鶏胚眼球外間葉組織にShh抑制物質cyclopamineを染み込ませたマイクロビーズを埋め込んで病理変化を検討した。
強制発現させ、内因性Pax6の発現をRT-PCRで検討した。Shhのgain-of-function in vivo実験として、鶏2-7日胚の眼球外間葉組織にShh遺伝子を電気穿孔法で導入し病理変化を検討した。Shhのloss-of-function実験として、同じく鶏胚眼球外間葉組織にShh抑制物質cyclopamineを染み込ませたマイクロビーズを埋め込んで病理変化を検討した。
結果と考察
新生仔ムコ多糖症角膜混濁の遺伝子治療:生後早期にAxCAhGUSを投与されたムコ多糖症VII型マウスの角膜および網膜におけるβ-グルクロニダーゼ活性染色を行ったところ、ほとんどがβ-グルクロニダーゼ陽性細胞であった。角膜および網膜上皮の組織病理所見は、生後早期にウイルスベクター投与を受けたムコ多糖症VII型マウスでは無治療マウスと比較して、角膜組織および網膜上皮における空胞変性細胞の数および腫大が明らかに減少していた。これらの結果から生後早期のAxCAhGUS全身投与により角膜および網膜に遺伝子導入は可能となり病理組織の改善があることが確認された。新生仔期にAxCAhGUSを経静脈的に全身投与することよりにムコ多糖症VII型マウスの角膜や網膜に対し、遺伝子導入が可能であることが示された。生後早期であれば、全身投与で角膜や網膜に遺伝子導入が可能であり、成熟期では治療が困難である角膜混濁や網膜病変の改善が認められ、今後幹細胞移植などによる眼組織の再生や修復による根治的な治療と、アデノウイルスベクターによる一過性の高い遺伝子導入効率をもつ遺伝子治療の組み合わせが現実的であると考える。2)Cre/lox Pシステムを用いたcaspase 8導入による水晶体上皮細胞増殖の抑制:通常のCAGプロモータを用いたアデノウイルスを用いた場合は、水晶体上皮細胞にアポトーシスがみられ、同時に隅角や網膜の細胞にも同様にアポトーシスがみられた。しかし、クリスタリンプロモータを用いたCre/loxPシステムウイルスベクターを投与した場合は、水晶体上皮細胞には高率でアポトーシスが起こったが、隅角や網膜にはアポトーシス細胞はみられなかった。臨床応用のためには、第一に発現効率の向上が重要である。また、このような系はその組織特異性から白内障治療の際の薬物投与などにも応用できる可能性があると考えられた。3)レンズ細胞特異的転写因子MafA/L-Maf:L-maf遺伝子の哺乳類ホモログ(mafAと命名)は、クリスタリン遺伝子群の転写制御領域に存在するDNA配列(MARE)に結合し、転写を活性化することを確認した。MafAは膵島β細胞でのみ発現がみられたことから派生して、MafAがインスリン遺伝子の膵島β細胞特異的かつグルコース濃度依存的な転写制御を行うことを見いだした。また、Maf関連遺伝子産物であり、哺乳類の水晶体の発生に必須なc-Mafが膵島α細胞に特異的に発現していてグルカゴン遺伝子の転写制御を行っていることも併せて見いだした。哺乳類の水晶体ではL-Mafホモログではなく関連遺伝子産物であるc-MafやMafBが発現しており、動物種によってMafファミリーの使い分けが異なっていると思われる。4)網膜特異的銅依存性アミン酸化酵素(AOC2)の機能解析:AOC2の周辺遺伝子について解析した結果、AOC2と最も相同性のあるAOC3遺伝子がわずか1Kb下流に存在することが明らかとなった。ラットAOC2はエクソン1にトランスポゾンDNAの挿入が確認され、ストップコドンが存在するために、127アミノ酸の未熟なタンパク質しか生成できないことが明らかとなった。AOC2のアミノ酸配列及び構造からこのタンパク質は2量体を形成してN末端は膜を貫通し、タンパク質の大部分は細胞質外に存在することが予測された。AOC2をCHO細胞で強制発現させて免疫染色した結果、このタンパク質が細胞外に存在することが明らかとなった。AOC2と縦列に存在するAOC3はVascular Adhesion Protein-1としてかなり詳しく解析されており、組織内の炎症箇所において血管内皮細胞やリンパ節で発現して遊走してくるリンパ球の捕捉や細胞内への誘導を行う。大腸菌銅依存性アミン酸化酵素の結晶構造からAOC2とAOC3はきわめて類似しており、アミノ酸配列から予測された、モチーフ、活性部位、銅接着部位、糖修飾部位など、多くの点
について類似していることが明らかとなった。AOC2はAOC3から誕生したと考えられ、AOC3が組織特異的でないのとは対照的にAOC2は網膜特異的な遺伝子として進化を遂げたと考えられる。5)幹細胞から眼組織への分化に関する研究:MAPキナーゼ系がES細胞の生存維持や分化誘導に必須の役割を果たすこと,またニワトリ同様、マウスにおいても色素上皮にはPax6感受性の幹細胞が存在し網膜組織へと分化誘導可能であることを見い出した。ショウジュウバエの眼形成にはMAPキナーゼによるEyaを含む転写因子のリン酸化が遺伝子発現の制御に関与していることが示されている。マウス眼形成においても眼形成関連の転写因子を制御している可能性が示唆された。また、哺乳動物においても幹細胞から網膜組織を構築できることが示唆された。6)幹細胞から網膜細胞への分化誘導に関する研究:発生期網膜細胞のpellet培養中にES細胞を混合して培養したところ,ES細胞の多くが神経幹細胞のマーカーとされるnestinを発現した細胞に分化することが確認された。また,ES細胞がmap2陽性の神経細胞,GFAP陽性の星状グリア細胞等の神経系細胞に分化していることも確認された。ES細胞由来の細胞中において,オプシン等,網膜細胞に特有な分子の発現は確認されていないが,現在この点に関してはさらに詳細な検討を行っている。ES細胞の胎生期網膜への移植に関しては,妊娠母体を麻酔したうえで開腹し,子宮壁上から直接眼球内に細胞を移植するという方法をとっている。移植する細胞の量,具体的な移植手技等に関する検討を行ったうえで最適と考えられた条件を設定することはできたと考えている。ES細胞に関しては,これを培養下で発生期網膜の環境に暴露することによりこの細胞を神経系細胞へと分化誘導可能であることが明らかにされた。しかしながら,現時点では網膜細胞に特有の分子の発現を誘導するに至っていない状況である。今後,これらの神経系細胞に網膜固有のアイデンティティーを付与するための何らかの工夫を行うなど,さらに検討が必要であると考えている。7)細胞外シグナル伝達物質Shhの網膜形成への役割:Holoprosencephalyの軽症例2例でE167G とV185MのShh変異がみつかり、いずれも眼底には黄斑の位置異常や形成不全がみられた。ShhのPax6発現に対する生化学的検討では、Shh-WTはPatchedやGli1の発現を亢進し、Pax6の発現を抑制したが、みつかった変異体ではこの効果がみられなかった。Shhのgain-of-functionに関するin vivo実験で、Shhを眼球外に過剰導入すると、その付近の網膜の形成が遅れ、Pax6の発現も抑制された。Loss-of-functionに関するin vivo実験では、cyclopamineを染み込ませたマイクロビーズを埋め込んだ付近の網膜は厚くなり、Pax6の発現が亢進していた。軽度のholoprosencephalyで顔面形成異常が起こる機転は不明であったが、最近、発生の比較的初期で顔面正面にShhが発現し、この異常で顔面形成異常が起こることが明らかになった。黄斑は顔面の反対側に位置する。顔面正面からのShhに濃度勾配があれば、眼球の対側にある黄斑領域ではShhによるPax6の抑制効果が最も少なくなり、網膜形成が相対的に最も高度になる。昨年度、Pax6(+5a) isoformが黄斑領域に発現して高度な網膜形成を行っていることを明らかにしたが、今回のShhの位置情報と合わせて、高度な視覚の形成が決定されると考えられる。このような網膜の細胞密度、分化を決めるシステムの解明は、正常に近い視感度をもつ網膜再生のために有用と思われる。
について類似していることが明らかとなった。AOC2はAOC3から誕生したと考えられ、AOC3が組織特異的でないのとは対照的にAOC2は網膜特異的な遺伝子として進化を遂げたと考えられる。5)幹細胞から眼組織への分化に関する研究:MAPキナーゼ系がES細胞の生存維持や分化誘導に必須の役割を果たすこと,またニワトリ同様、マウスにおいても色素上皮にはPax6感受性の幹細胞が存在し網膜組織へと分化誘導可能であることを見い出した。ショウジュウバエの眼形成にはMAPキナーゼによるEyaを含む転写因子のリン酸化が遺伝子発現の制御に関与していることが示されている。マウス眼形成においても眼形成関連の転写因子を制御している可能性が示唆された。また、哺乳動物においても幹細胞から網膜組織を構築できることが示唆された。6)幹細胞から網膜細胞への分化誘導に関する研究:発生期網膜細胞のpellet培養中にES細胞を混合して培養したところ,ES細胞の多くが神経幹細胞のマーカーとされるnestinを発現した細胞に分化することが確認された。また,ES細胞がmap2陽性の神経細胞,GFAP陽性の星状グリア細胞等の神経系細胞に分化していることも確認された。ES細胞由来の細胞中において,オプシン等,網膜細胞に特有な分子の発現は確認されていないが,現在この点に関してはさらに詳細な検討を行っている。ES細胞の胎生期網膜への移植に関しては,妊娠母体を麻酔したうえで開腹し,子宮壁上から直接眼球内に細胞を移植するという方法をとっている。移植する細胞の量,具体的な移植手技等に関する検討を行ったうえで最適と考えられた条件を設定することはできたと考えている。ES細胞に関しては,これを培養下で発生期網膜の環境に暴露することによりこの細胞を神経系細胞へと分化誘導可能であることが明らかにされた。しかしながら,現時点では網膜細胞に特有の分子の発現を誘導するに至っていない状況である。今後,これらの神経系細胞に網膜固有のアイデンティティーを付与するための何らかの工夫を行うなど,さらに検討が必要であると考えている。7)細胞外シグナル伝達物質Shhの網膜形成への役割:Holoprosencephalyの軽症例2例でE167G とV185MのShh変異がみつかり、いずれも眼底には黄斑の位置異常や形成不全がみられた。ShhのPax6発現に対する生化学的検討では、Shh-WTはPatchedやGli1の発現を亢進し、Pax6の発現を抑制したが、みつかった変異体ではこの効果がみられなかった。Shhのgain-of-functionに関するin vivo実験で、Shhを眼球外に過剰導入すると、その付近の網膜の形成が遅れ、Pax6の発現も抑制された。Loss-of-functionに関するin vivo実験では、cyclopamineを染み込ませたマイクロビーズを埋め込んだ付近の網膜は厚くなり、Pax6の発現が亢進していた。軽度のholoprosencephalyで顔面形成異常が起こる機転は不明であったが、最近、発生の比較的初期で顔面正面にShhが発現し、この異常で顔面形成異常が起こることが明らかになった。黄斑は顔面の反対側に位置する。顔面正面からのShhに濃度勾配があれば、眼球の対側にある黄斑領域ではShhによるPax6の抑制効果が最も少なくなり、網膜形成が相対的に最も高度になる。昨年度、Pax6(+5a) isoformが黄斑領域に発現して高度な網膜形成を行っていることを明らかにしたが、今回のShhの位置情報と合わせて、高度な視覚の形成が決定されると考えられる。このような網膜の細胞密度、分化を決めるシステムの解明は、正常に近い視感度をもつ網膜再生のために有用と思われる。
結論
ムコ多糖症VII型モデルマウスの角膜混濁および網膜変性に対する生後早期におけるアデノウイルスベクターによって欠損遺伝子を補充し、遺伝子治療法の有効性を明らかにした。Cre/lox P 系・アデノウイルスベクターを用いたCaspase8導入による家兎水晶体上皮細胞増殖の抑制実験を行い、後発白内障の治療として応用できる可能性を示した。水晶体細胞特異的な遺伝子発現を司る転写因子MafA/L-Mafとc-Mafの発現と機能を解析した。緑内障で最も障害を受ける網膜神経節細胞で発現する網膜特異的アミン酸化酵素(AOC2)を検討し、血管内皮細胞でリンパ球の接着機
能を持ち、VAP-1からタンパク質進化して網膜特異的な機能を持つに至ったと考えられた。幹細胞の特性を明らかにする目的で、マウス胚性幹(ES)細胞の生存・死・分化誘導を主要な細胞内情報伝達系であるMAPキナーゼ(ERKやSAPK/JNK)系や眼形成関連の転写因子PAX6の観点から検討した。その結果、ES細胞の生存維持にはERK系が、分化誘導に伴う遺伝子発現にはSAPK/JNK系が関与することを見い出した。また、PAX6遺伝子をマウス胎児の色素上皮に導入することによって、ニワトリ同様に網膜組織へと分化誘導する可能であることを見い出した。ES細胞の可能性を検証する目的で,in vitro,in vivoにおいて発生期マウス網膜の環境の中に置かれたマウスES細胞の網膜細胞への分化の可能性を検討した。in vitroで発生期網膜細胞と混合培養されたES細胞の多くは神経系細胞へと分化することが明らかとなった。シグナル伝達物質ShhがPax6を制御して網膜の分化を決定している証拠を得た。顔面で発現するShhがPax6の発現に影響を及ぼし、網膜の分化や眼球の形態、ひいては黄斑の位置付けや視線を決定していることが示唆された。
能を持ち、VAP-1からタンパク質進化して網膜特異的な機能を持つに至ったと考えられた。幹細胞の特性を明らかにする目的で、マウス胚性幹(ES)細胞の生存・死・分化誘導を主要な細胞内情報伝達系であるMAPキナーゼ(ERKやSAPK/JNK)系や眼形成関連の転写因子PAX6の観点から検討した。その結果、ES細胞の生存維持にはERK系が、分化誘導に伴う遺伝子発現にはSAPK/JNK系が関与することを見い出した。また、PAX6遺伝子をマウス胎児の色素上皮に導入することによって、ニワトリ同様に網膜組織へと分化誘導する可能であることを見い出した。ES細胞の可能性を検証する目的で,in vitro,in vivoにおいて発生期マウス網膜の環境の中に置かれたマウスES細胞の網膜細胞への分化の可能性を検討した。in vitroで発生期網膜細胞と混合培養されたES細胞の多くは神経系細胞へと分化することが明らかとなった。シグナル伝達物質ShhがPax6を制御して網膜の分化を決定している証拠を得た。顔面で発現するShhがPax6の発現に影響を及ぼし、網膜の分化や眼球の形態、ひいては黄斑の位置付けや視線を決定していることが示唆された。
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