文献情報
文献番号
200300399A
報告書区分
総括
研究課題名
造血系再生医療への応用を目的とした増殖分化制御システムの開発研究(総括研究報告書)
課題番号
-
研究年度
平成15(2003)年度
研究代表者(所属機関)
小澤 敬也(自治医科大学)
研究分担者(所属機関)
- 久米晃啓(自治医科大学)
- 花園豊(自治医科大学)
- 長谷川護(ディナベック研究所)
- 寺尾恵治(国立感染症研究所筑波霊長類センター)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 総合的プロジェクト研究分野 ヒトゲノム・再生医療等研究（再生医療分野）
研究開始年度
平成15(2003)年度
研究終了予定年度
平成16(2004)年度
研究費
49,200,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
再生医療は大きな発展が期待される新規医療技術であり、体性幹細胞あるいはES細胞を利用するアプローチに大別される。前者の代表が造血幹細胞移植であるが、そこにさらに細胞制御技術を絡ませることにより、臨床応用の可能性を一段と拡げることが可能となる。本研究では、患者自身の造血幹細胞を機能修復して自家移植する細胞治療法において、第二世代選択的増幅遺伝子(SAG: selective amplifier gene)を利用することにより、移植した修復造血系細胞の体内での選択的増幅を誘導し、治療効果の増強を図る技術の開発を推進した。このシステムを慢性肉芽腫症の幹細胞治療に応用するため、本年度は疾患モデルマウスや霊長類のサルを用いた実験系で前臨床研究を行った。体性幹細胞を利用するもう一つの研究テーマは、分化転換技術により非造血系組織から造血系を再生させるプロジェクトである。幹細胞の生理的可塑性は限定的であるため、遺伝子操作技術の応用が鍵となる。具体的には、筋肉に脱分化誘導遺伝子を導入して一時的に作用させることにより、脱分化段階を経て、骨格筋細胞から造血系再構築能を持った細胞に再分化させるという、全く新しい再生医療技術の開発に取り組んだ。本年度は、基礎データの確認に力を入れた。後天性難治性造血器疾患においてゲノムに異常の生じていない患者自身の非造血系組織から正常造血系を再生することが可能になれば、将来的には画期的な治療法の開発に繋がるものと期待される。もう一つのES細胞を利用する再生医療に関しては、ヒトへの応用展開を考慮し、霊長類のサルのES細胞を用いたin vitro分化誘導実験や、個体レベルの研究を行った。また、造血幹細胞やES細胞の遺伝子操作に関して、安全性を高めるため、染色体部位特異的遺伝子組込み法の開発を進めた。最近、造血幹細胞遺伝子治療で白血病の発生が深刻な問題となっており、このような基盤技術は重要な研究テーマとなっている。
研究方法
1)選択的増幅遺伝子(SAG)を利用した造血系細胞体内増幅法の開発と応用:EPO反応型の第二世代SAG[EPO受容体細胞外領域とMpl受容体の細胞内領域の融合蛋白質をコードする遺伝子]について、サルの系で造血系再構築実験を行い、その有効性を検討した。尚、移植前処置の代わりに、骨髄還流置換法(池原法)を行った。即ち、サルの大腿骨および上腕骨のそれぞれ両端に針を刺し、骨髄腔を洗浄した。その後、遺伝子導入CD34細胞を骨髄腔内に注入した。遺伝子導入効率はPCR法により調べた。疾患モデルでの治療実験としては、ヒトgp91遺伝子と第二世代SAGを搭載するレトロウイルスベクターを構築し、X連鎖慢性肉芽腫症(X-CGD)モデルマウス(gp91遺伝子ノックアウトマウス)の骨髄細胞に遺伝子導入した。これを致死量放射線照射X-CGDマウスに移植し、造血系再構築後EPOを投与することにより活性酸素産生能を回復した顆粒球が増えるか否かを追跡した。尚、平成15年9月13日の班会議では、このSAGプロジェクトを中心に話し合いを行った。さらに、韓国のソウル国立大学およびViroMed社との共同研究に向けたシンポジウムを平成15年11月8日にソウルで開催した。2)非造血系組織からの造血系再生を目指した分化転換技術の開発:骨格筋系細胞株を脱分化させる作用のあるMsx1に注目し、Msx1発現アデノ随伴ウイルスベクター(AAV/Msx1)を作製した。このベクターをマウス前脛骨筋に注射し、筋注後1週から4週にわたり、前脛骨筋から単核細胞を分離し、フローサイトメトリー解析ならびに造血系コロ
ニー形成実験を行った。3)霊長類ES細胞からの造血系再生技術の開発:(a) サルES細胞の遺伝子操作技術については、SeVベクターによる遺伝子導入法を検討した。(b) サルES細胞の造血系へのin vitro分化誘導技術については、ストローマ細胞OP9との共培養およびサイトカイン添加条件を検討した。また、ES細胞に対する同種免疫応答の程度をリンパ球混合培養での幼若化反応(MLR)で評価した。(c) サルES細胞の移植技術については、GFP遺伝子導入ES細胞を、サル胎仔の肝臓内または腹腔内へ移植した。移植後、適当な時期に胎仔を娩出し、移植細胞の生着・増殖・分化を調べた。4)染色体部位特異的遺伝子組込み(TVI: Targeted Vector Integration)法の開発:AAVの二つのコンポーネント(ITR配列とRep蛋白質)を利用し、第19番染色体長腕AAVS1領域に遺伝子を組み込ませる方法の応用開発を推進した。特に、Repを一過性に発現させるシステムの開発を行った。(倫理面への配慮)マウスを用いた実験では、動物倫理面(動物愛護上の配慮など)を含めて自治医大動実験指針規定に従って行った。筑波霊長類センターでのサルの実験は、国立感染症研究所「動物実験ガイドライン」および筑波霊長類センター「サル類での実験遂行指針」を遵守して行った。
ニー形成実験を行った。3)霊長類ES細胞からの造血系再生技術の開発:(a) サルES細胞の遺伝子操作技術については、SeVベクターによる遺伝子導入法を検討した。(b) サルES細胞の造血系へのin vitro分化誘導技術については、ストローマ細胞OP9との共培養およびサイトカイン添加条件を検討した。また、ES細胞に対する同種免疫応答の程度をリンパ球混合培養での幼若化反応(MLR)で評価した。(c) サルES細胞の移植技術については、GFP遺伝子導入ES細胞を、サル胎仔の肝臓内または腹腔内へ移植した。移植後、適当な時期に胎仔を娩出し、移植細胞の生着・増殖・分化を調べた。4)染色体部位特異的遺伝子組込み(TVI: Targeted Vector Integration)法の開発:AAVの二つのコンポーネント(ITR配列とRep蛋白質)を利用し、第19番染色体長腕AAVS1領域に遺伝子を組み込ませる方法の応用開発を推進した。特に、Repを一過性に発現させるシステムの開発を行った。(倫理面への配慮)マウスを用いた実験では、動物倫理面(動物愛護上の配慮など)を含めて自治医大動実験指針規定に従って行った。筑波霊長類センターでのサルの実験は、国立感染症研究所「動物実験ガイドライン」および筑波霊長類センター「サル類での実験遂行指針」を遵守して行った。
結果と考察
1)SAGを利用した造血系細胞体内増幅法の開発と応用:遺伝子導入CD34細胞のサルへの移植実験を以下のように実施した。a)SAG導入細胞を骨髄内に移植、b)非発現ベクターにて標識した細胞を骨髄内に移植、c)非発現ベクターにて標識した細胞を経静脈的に移植した。その結果、SAG導入細胞を骨髄内移植したサルでは、EPO投与に応じて末梢血中の遺伝子導入細胞が増加し、EPO投与を中断すると導入効率は速やかに減少した。経静脈的に移植を行ったサルでは、骨髄内移植法に比べて骨髄への生着率が悪かった。特に重大な副作用は認められなかった。gp91-EpoRMpl遺伝子導入細胞にて造血系を再構築したX-CGDマウスにEPOを反復投与する実験では、末梢血の機能回復顆粒球が増加した。今後は、エリスロポエチン受容体細胞外部分とG-CSF受容体細胞内部分を組み合わせた、新しいSAGシステムの応用を検討する計画である。尚、9月の班会議では、臨床用SAGの開発を急ぐことが確認された。11月に韓国で開催された共同研究に向けたシンポジウムでは、今後の課題と分担すべき検討事項について議論した。2)非造血系組織からの造血系再生を目指した分化転換技術の開発: Msx1を一過性に強制発現させることにより、骨格筋の中の造血前駆細胞が増加することが観察された。その中には顆粒球・単球系のみならず赤芽球系前駆細胞も含まれており、Msx1発現骨格筋から得られた細胞は、in vivo造血系再構築能を有することが期待される。3)霊長類ES細胞からの造血系再生技術の開発:(a) サルES細胞にSeVベクターでGFP遺伝子を導入すると、約60%の細胞がGFP蛍光を発し、その発現は数ヶ月以上持続した。また、遺伝子導入ES細胞は、ES細胞の三胚葉分化能を損なわないことが判明した。 (b)サルES細胞のin vitro分化誘導技術の開発では、OP9ストローマ細胞上で、SCF, IL-3, IL-6, BMP-4, VEGFを含む培地で培養すると、1週間～10日後に造血前駆細胞が出現し、1ヶ月後には好中球が出現した。また、ES細胞を刺激細胞とし、正常カニクイザル末梢単核球を反応細胞としたMLRでは、分化誘導した細胞に対する幼若化反応が認められた。同種免疫反応についても対策を考えていく必要がある。(c) サルES細胞の移植技術については、未分化ES細胞の移植を受けたサル胎仔で、広範な組織に移植細胞の生着を認めた。生着した細胞はその場に応じた分化を遂げることが明らかになった。この系は、今後のES細胞移植治療の有効性や安全性を評価するための系として有用である。尚、移植針の軌跡に沿った胸腔や腹腔内にテラトーマ形成がみられた。4)染色体部位特異的遺伝子組込み(TVI: Targeted Vector Integration)法の開発:Rep発現誘導カセットを導入したHeLa細胞にCre発現ベクターを感染させ、CreによってRepの発現が誘導されることを確認した。
結論
ヒトに近縁であるカニクイザルを用いて、全身放
射線照射や抗がん剤大量投与などの前処置を行うことなく、骨髄内移植法により遺伝子導入細胞を生着させることができた。さらにSAGシステムを併用することにより、1年以上の長期間に渡り、末梢血における遺伝子導入効率を10%近くまで高めること(EPO投与時)に成功した。また、CGDモデルマウスの系でも、SAGシステムを利用した造血幹細胞遺伝子治療の有効性が確認された。骨格筋組織の人為的分化転換に関する基礎研究では、非造血系組織から造血系を再構築できる可能性を示すことができた。霊長類(サル)ES細胞から造血系再生に必要な基盤技術に関して、SeVベクターを用いた遺伝子導入法、造血系へのin vtro分化誘導法、サル胎仔への同種移植技術を開発した。その他、TVI法の開発研究を推進した。
射線照射や抗がん剤大量投与などの前処置を行うことなく、骨髄内移植法により遺伝子導入細胞を生着させることができた。さらにSAGシステムを併用することにより、1年以上の長期間に渡り、末梢血における遺伝子導入効率を10%近くまで高めること(EPO投与時)に成功した。また、CGDモデルマウスの系でも、SAGシステムを利用した造血幹細胞遺伝子治療の有効性が確認された。骨格筋組織の人為的分化転換に関する基礎研究では、非造血系組織から造血系を再構築できる可能性を示すことができた。霊長類(サル)ES細胞から造血系再生に必要な基盤技術に関して、SeVベクターを用いた遺伝子導入法、造血系へのin vtro分化誘導法、サル胎仔への同種移植技術を開発した。その他、TVI法の開発研究を推進した。
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