文献情報
文献番号
200300364A
報告書区分
総括
研究課題名
有害反応の回避を目指した副作用原因遺伝子の同定とSNPの探索
課題番号
-
研究年度
平成15(2003)年度
研究代表者(所属機関)
千葉 寛(千葉大学薬学研究院)
研究分担者(所属機関)
- 上田志朗(千葉大学薬学研究院)
- 田中敏博(理化学研究所多型解析センター)
- 大江 透(岡山大学大学院医歯学総合研究科)
- 小川 聡(慶応大学医学部)
- 清水 渉(国立循環器病センター)
- 中谷晴昭(千葉大学大学院医学研究院)
- 白川太郎(京都大学大学院医学研究科)
- 橋本公二(愛媛大学医学部)
- 伊崎誠一(埼玉医科大学総合医療センター)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 総合的プロジェクト研究分野 ヒトゲノム・再生医療等研究（ヒトゲノム・遺伝子治療・生命倫理分野）
研究開始年度
平成13(2001)年度
研究終了予定年度
平成15(2003)年度
研究費
60,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
医薬品は有効性と有害作用の相反する二面性を有しており、現代の科学技術を持ってしても有害な面を全く持たない医薬品を創製することは困難である。このわずかに残された有害作用に一部の患者は敏感に反応し、予想できない反応を示し、死に至ることもある。本研究の目的は、このような有害反応の原因遺伝子とSNP (single nucleotide polymorphism)を明かにし、有害反応を未然に回避するための有効な方法を確立することにある。そのための具体的な目標として、重篤な場合は死に至ることもある、1)薬物誘起性横紋筋融解症2)薬物誘起性QT延長症候群、まれではあるが、致死率の高い全身性の皮膚障害を引き起こす3)Stevens-Johnson 症候群(皮膚・粘膜・眼症候群)を取り上げ、その原因となる遺伝子とそのSNPを明らかにすることを目的とした。
研究方法
遺伝子解析チーム、DNA試料収集チーム及び機能解析グループの連携により研究を遂行した。DNA試料収集チームは、横紋筋融解症を上田が、QT延長症候群を大江、小川、清水が、Stevens-Johnson症候群を橋本と伊崎が担当し患者からのICの取得と検体の収集を行った。遺伝子解析チームはHMGCoA還元酵素阻害薬(スタチン)による横紋筋融解症の遺伝子解析を千葉が、薬物誘起性QT延長症候群を田中が、Stevens-Johnson症候群を白川が担当し、候補遺伝子の解析を行った。機能解析については、横紋筋融解症を千葉が、QT延長に関しては中谷が担当した。ヒトゲノム検体の収集と解析にあたっては「ヒトゲノム解析研究に関する共通指針」を尊守し、倫理委員会の承認を得た後、提供者の同意を得て行った。
結果と考察
1) 薬剤性横紋筋融解症
先天性横紋筋融解症に関連するエネルギー産生系遺伝子として、Very-long-chain acyl-CoA degydrogenase (VLCAD), Carnitine palmitoyltransferase II (CPTII), Myophosphorypase (PYGM), Lactate dehydrogenase-A (LDHA)の4遺伝子を、薬物動態関連遺伝子としては、HMG-CoA還元酵素阻害薬の動態に関係している酵素とトランスポーターとして、Organic anion transportong polypeptide-C (OATPC), Multidrug resistance protein 1 (MDR1), Multidrug resistance protein 2 (MRP2), CYP3A4の4遺伝子を候補遺伝子として解析を行った。対象はスタチンを服用中横紋筋融解症の疑いありと診断された患者(症例群、10例)およびスタチンを服用しても筋肉症状の現れなかった患者(対照群、26例)である。これらの患者を対象に、遺伝子解析を行った結果、エネルギー産生系遺伝子、MRP2、CYP3A4については、症例群に変異が見いだされないか、見いだされた場合でもその頻度に対照群との間で差が見いだされなかった。それに対し、OATP-Cの場合、プラバスタチン、アトルバスタチン服用症例群におけるT521Cのアレル頻度(症例6例、アレル頻度、0.500) が対照群(22例、アレル頻度、0.114)に比較して有意(P=0.003)に高いことが明らかになった。次に、連鎖を考慮した解析を行うためハプロタイプ解析を行った。その結果、*1a/*15, *1b / *15の頻度が症例群で高い傾向が認められ、ハプロタイプ頻度で比較すると、OATP-C*15の頻度が症例群(0.500)で対照群(0.114)と比較して有意に(P=0.01)高いことが示された。さらに、OATP*15を1アレル以上有する患者の頻度を比較したところ、症例群(0.833)におけるOATP-C*15の保持率が対照群(0.182)に比較して有意に高いことが示された(P=0.002, Odd's ratio=22.5, 95%CI=2.03 - 249)。これらの知見を基にOATP-Cの*15*に含まれる2つのcSNP(388G,T521C)と症例群で見いだされたまれな変異であるC1007Gの全組み合わせのアレル変異体を作製し、スタチンの取り込み速度への影響を各変異体間で比較した。その結果、OATP-Cを一過的に発現させたHek293細胞におけるプラバスタチン、アトルバスタチンの輸送活性は T521Cの変異により顕著に低下(野生型の1/6)した。さらに、速度論的解析結果から,変異によるプラバスタチンとアトルバスタチンの輸送速度の低下は,基質親和性(Km)の変化では無く,経細胞輸送に機能しうるたん白量(Vmax)の変化によるものであること、さらに、免疫組織化学染色の結果より,T521Cの変異による細胞膜へのOATP-Cたん白の移行の低下が確認されたことから,*15による輸送活性低下はソーティング異常が原因と考えられた。以上の結果からOATP-C*15を持つ患者がプラバスタチンなどのスタチンを服用した場合、肝臓への取り込みが低下しているため循環血中から筋組織に暴露されるスタチンが野生型の遺伝子を持つ患者よりも高くなり、横紋筋融解症を発症する危険性が高まる可能性が考えられた。一方、MDR1については2677Aのアレル頻度がシンバスタチンまたはアトルバスタチン服用患者に限定して解析した場合、両群間で頻度が異なる傾向が認められた(症例0.333、対照0.000)。さらに、2677Aアレルを1つ以上有する患者とそうでない患者の頻度は症例-対照間で有意に異なっており、2677Aがシンバスタチンのような脂溶性スタチンによる横紋筋融解症に何らかの影響をおよぼしている可能性が示唆された。
2)薬剤性QT延長症候群
KCNQ1, KCNH2, SCN5A, KCNE1, KCNE2, KCNA10, KCNJ11, KCNK6, ADRB1, SLC18A1, SLC18A2, SLC6A2の計12遺伝子で同定されているアミノ酸変化を伴うSNP計27箇所について,2次性QT延長症候群と診断された45症例のゲノムDNAサンプルを用いてタイピングを行った。その結果、不整脈を惹起した原因薬剤別SNPの頻度を対照群と比較した場合、P値が0.05より低いSNPsが9個見いだされ、これらの内4個のSNPsはBonferoniの補正後も比較的低い(0.1以下)P値を示した。特に、ピルメノールが原因でQT延長を起こした患者のKCNK6の775G>AについてはBonferoniの補正後も患者群で有意に(P<0.05)高いことが明らかになった。
3)Stevens-Johnson症候群
現在までに得られた28症例のうち、15症例を対象に約30の候補遺伝子のSNP解析を行い、FASL遺伝子のpromoter領域にある-844C/T変異とSJSとの間に有意な相関を見いだした(p=0.034, Fisher's exact test)。そのため、解析が可能であった総ての症例(26症例)について検討を行ったところ、対照群と比較して有意に-844Tアレルが多いことが明らかになった。FASLはFAS抗原に結合することによりFAS抗原発現細胞にアポトーシスを引き起こすligandであり、TNFファミリーに属する膜たんぱく質として活性化T細胞に発現している。また、FASLはプロテアーゼによって切断され、可溶化FASL(S-FASL)となって血中や組織中に移行する。これまでに、Stevens-Johnson症候群とその進行した病態と考えられているtoxic epidermal necrolysisの患者ではS-FASLが高いことが明らかにされており、ヒトイムノグロブリンの静注がtoxic epidermal necrolysisの患者における皮膚の壊死の進行を阻止したとの報告もある。今回見いだされたFASLの-844C/TはFASLの発現量に影響を与えるとの報告があることから、このSNPがStevens-Johnson症候群の発症に何らかの役割を果たしている可能性が示唆された。
先天性横紋筋融解症に関連するエネルギー産生系遺伝子として、Very-long-chain acyl-CoA degydrogenase (VLCAD), Carnitine palmitoyltransferase II (CPTII), Myophosphorypase (PYGM), Lactate dehydrogenase-A (LDHA)の4遺伝子を、薬物動態関連遺伝子としては、HMG-CoA還元酵素阻害薬の動態に関係している酵素とトランスポーターとして、Organic anion transportong polypeptide-C (OATPC), Multidrug resistance protein 1 (MDR1), Multidrug resistance protein 2 (MRP2), CYP3A4の4遺伝子を候補遺伝子として解析を行った。対象はスタチンを服用中横紋筋融解症の疑いありと診断された患者(症例群、10例)およびスタチンを服用しても筋肉症状の現れなかった患者(対照群、26例)である。これらの患者を対象に、遺伝子解析を行った結果、エネルギー産生系遺伝子、MRP2、CYP3A4については、症例群に変異が見いだされないか、見いだされた場合でもその頻度に対照群との間で差が見いだされなかった。それに対し、OATP-Cの場合、プラバスタチン、アトルバスタチン服用症例群におけるT521Cのアレル頻度(症例6例、アレル頻度、0.500) が対照群(22例、アレル頻度、0.114)に比較して有意(P=0.003)に高いことが明らかになった。次に、連鎖を考慮した解析を行うためハプロタイプ解析を行った。その結果、*1a/*15, *1b / *15の頻度が症例群で高い傾向が認められ、ハプロタイプ頻度で比較すると、OATP-C*15の頻度が症例群(0.500)で対照群(0.114)と比較して有意に(P=0.01)高いことが示された。さらに、OATP*15を1アレル以上有する患者の頻度を比較したところ、症例群(0.833)におけるOATP-C*15の保持率が対照群(0.182)に比較して有意に高いことが示された(P=0.002, Odd's ratio=22.5, 95%CI=2.03 - 249)。これらの知見を基にOATP-Cの*15*に含まれる2つのcSNP(388G,T521C)と症例群で見いだされたまれな変異であるC1007Gの全組み合わせのアレル変異体を作製し、スタチンの取り込み速度への影響を各変異体間で比較した。その結果、OATP-Cを一過的に発現させたHek293細胞におけるプラバスタチン、アトルバスタチンの輸送活性は T521Cの変異により顕著に低下(野生型の1/6)した。さらに、速度論的解析結果から,変異によるプラバスタチンとアトルバスタチンの輸送速度の低下は,基質親和性(Km)の変化では無く,経細胞輸送に機能しうるたん白量(Vmax)の変化によるものであること、さらに、免疫組織化学染色の結果より,T521Cの変異による細胞膜へのOATP-Cたん白の移行の低下が確認されたことから,*15による輸送活性低下はソーティング異常が原因と考えられた。以上の結果からOATP-C*15を持つ患者がプラバスタチンなどのスタチンを服用した場合、肝臓への取り込みが低下しているため循環血中から筋組織に暴露されるスタチンが野生型の遺伝子を持つ患者よりも高くなり、横紋筋融解症を発症する危険性が高まる可能性が考えられた。一方、MDR1については2677Aのアレル頻度がシンバスタチンまたはアトルバスタチン服用患者に限定して解析した場合、両群間で頻度が異なる傾向が認められた(症例0.333、対照0.000)。さらに、2677Aアレルを1つ以上有する患者とそうでない患者の頻度は症例-対照間で有意に異なっており、2677Aがシンバスタチンのような脂溶性スタチンによる横紋筋融解症に何らかの影響をおよぼしている可能性が示唆された。
2)薬剤性QT延長症候群
KCNQ1, KCNH2, SCN5A, KCNE1, KCNE2, KCNA10, KCNJ11, KCNK6, ADRB1, SLC18A1, SLC18A2, SLC6A2の計12遺伝子で同定されているアミノ酸変化を伴うSNP計27箇所について,2次性QT延長症候群と診断された45症例のゲノムDNAサンプルを用いてタイピングを行った。その結果、不整脈を惹起した原因薬剤別SNPの頻度を対照群と比較した場合、P値が0.05より低いSNPsが9個見いだされ、これらの内4個のSNPsはBonferoniの補正後も比較的低い(0.1以下)P値を示した。特に、ピルメノールが原因でQT延長を起こした患者のKCNK6の775G>AについてはBonferoniの補正後も患者群で有意に(P<0.05)高いことが明らかになった。
3)Stevens-Johnson症候群
現在までに得られた28症例のうち、15症例を対象に約30の候補遺伝子のSNP解析を行い、FASL遺伝子のpromoter領域にある-844C/T変異とSJSとの間に有意な相関を見いだした(p=0.034, Fisher's exact test)。そのため、解析が可能であった総ての症例(26症例)について検討を行ったところ、対照群と比較して有意に-844Tアレルが多いことが明らかになった。FASLはFAS抗原に結合することによりFAS抗原発現細胞にアポトーシスを引き起こすligandであり、TNFファミリーに属する膜たんぱく質として活性化T細胞に発現している。また、FASLはプロテアーゼによって切断され、可溶化FASL(S-FASL)となって血中や組織中に移行する。これまでに、Stevens-Johnson症候群とその進行した病態と考えられているtoxic epidermal necrolysisの患者ではS-FASLが高いことが明らかにされており、ヒトイムノグロブリンの静注がtoxic epidermal necrolysisの患者における皮膚の壊死の進行を阻止したとの報告もある。今回見いだされたFASLの-844C/TはFASLの発現量に影響を与えるとの報告があることから、このSNPがStevens-Johnson症候群の発症に何らかの役割を果たしている可能性が示唆された。
結論
1)薬剤性横紋筋融解症:OATP-C*15はプラバスタチンまたはアトルバスタチンの肝臓への取り込み能を低下させ,循環血中から筋組織に移行するスタチンの量を多くするため、横紋筋融解症発症の危険性を高めると考えられた。
2)薬剤性QT延長症候群:ピルメノールが原因でQT延長を起こした患者ではKCNK6の775G>Aが有意に高いことが明らかとなった。今後このSNPがKCNK6の機能に与える影響を検討し、薬剤性QT延長症候群の原因遺伝子である可能性を明らかにしたい。
3)Stevens-Johnson症候群:Stevens-Johnson症候群の患者群に有意に高いSNPをFASL遺伝子のpromoter領域に見いだした。これまでに、Stevens-Johnson症候群とその進行した病態と考えられているtoxic epidermal necrolysisの患者ではS-FASLが高いことが明らかにされていることから、このSNPがStevens-Johnson症候群の発症に何らかの役割を果たしている可能性が示唆された。
2)薬剤性QT延長症候群:ピルメノールが原因でQT延長を起こした患者ではKCNK6の775G>Aが有意に高いことが明らかとなった。今後このSNPがKCNK6の機能に与える影響を検討し、薬剤性QT延長症候群の原因遺伝子である可能性を明らかにしたい。
3)Stevens-Johnson症候群:Stevens-Johnson症候群の患者群に有意に高いSNPをFASL遺伝子のpromoter領域に見いだした。これまでに、Stevens-Johnson症候群とその進行した病態と考えられているtoxic epidermal necrolysisの患者ではS-FASLが高いことが明らかにされていることから、このSNPがStevens-Johnson症候群の発症に何らかの役割を果たしている可能性が示唆された。
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