文献情報
文献番号
200300202A
報告書区分
総括
研究課題名
アルツハイマー病発症の分子機構におけるコレステロールの役割の検討
課題番号
-
研究年度
平成15(2003)年度
研究代表者(所属機関)
道川 誠(国立長寿医療センター(研究所)アルツハイマー病研究部)
研究分担者(所属機関)
- 伊藤仁一(名古屋市立大学医学部第一生化学講座)
- 藤野貴広(東北大学遺伝子実験施設)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 総合的プロジェクト研究分野 長寿科学総合研究
研究開始年度
平成14(2002)年度
研究終了予定年度
平成16(2004)年度
研究費
25,350,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
我が国をはじめとした先進諸国においては急速に人口の高齢化が進み、様々な社会的課題が生じている。医学面では老年人口の増加に伴い痴呆など高齢者特有の疾患に対する予防法ならびに治療法の確立が求められている。高齢者の痴呆の原因としてアルツハイマー病は大きな割合を占める。アポリポタンパクE(apoE)の対立遺伝子ε4がアルツハイマー病の危険因子であることから、アルツハイマー病の発症機構をコレステロール代謝との関連で検討することが重要である。本研究班ではアルツハイマー病の発症機構におけるコレステロールおよびapoEの役割を明らかにする為に、コレステロール量変化に連動したタウのリン酸化、シナプス形成能、細胞生存への影響の機序の解明(主任研究者)、脳内コレステロール代謝恒常性維持におけるアストロサイトの役割の検討(分担研究者)、apoE受容体機能のシナプス形成能、タウのリン酸化制御に対する影響の検討(分担研究者)を行う。本研究の知見は、アルツハイマー病の治療法および予防法の開発に有用な情報を提供するものと期待される。
研究方法
神経細胞培養:
(道川) 新生仔マウス(生後1-2日目)大脳皮質からのアストロサイト培養、得られた検体の脂質生化学的および生化学的解析は、既に報告した方法(Michikawa M. et al, J Neurosci, 2001)により行った。ラットアストロサイトの培養では、胎生期17日目のラット胎児脳より大脳を摘出し血管、髄膜除去、脳細片後、1% trypsin溶液で処理して10%FCS含有 F-10 培地で1週間培養し、primary cultureとした。この細胞を再度 1% trypsin溶液で処理し、ピペッティング後 6-well multitrayあるいは petri dish (直径 15cm)に播種し、1週間 secondary cultureし、実験に供した。脂質分析では、diacylglyceride (DG), cholesterol (Cho), sphingomyelin (SM), phosphatidylcholine (PC) 合成には3H-acetate を用い、TLCによって分析した。また培地中に分泌されるHDLの分析はsucroseで培地の密度を 1.2 - 1.007 g/ml に調整し、48時間 49,000 rpm で遠心し、各フラクションの密度と脂質分布を分析し密度 1.2 - 1.08 をHDL 画分とした。細胞内リポタンパクの分析:ラットアストロサイトに 40 uCi/ml の 3H-acetate を2時間取り込ませてコレステロールを代謝的に3H 標識した。細胞を洗浄して、5 ug/mlのapoAI を90分作用させ、低張液で細胞を処理し、300,000 x g, 30 min の超遠心で細胞質を得た。細胞質を1.175 g/ml の sucrose 溶液に重層して、49,000 rpm , 48 h 遠心した。これを12画分に分け、それぞれの画分より脂質を抽出し、TLC により分析した。
(伊藤)細胞質の調製:培養アストロサイトを 0.02M Tris-HCl buffer, pH 7.5, containing protease inhibitor (0.02M Tris) により回収し、5分間毎に20回強く撹拌し、これを3回くり返した。90,000 rpm で 30 分間遠心し、得られた上清を細胞質画分とした。培養ろ液の脂質分析:diacylglyceride (DG), cholesterol (Cho), sphingomyelin (SM), phosphatidylcholine (PC) 合成には3H-acetate を用い、TLCによって分析した。また培地中に分泌されるHDLの分析はsucroseで培地の密度を 1.2 - 1.007 g/ml に調整し、48時間 49,000 rpm で遠心し、各フラクションの密度と脂質分布を分析し密度 1.2 - 1.08 をHDL 画分とした。細胞内リポタンパクの分析:ラットアストロサイトに 40 uCi/ml の 3H-acetate を2時間取り込ませてコレステロールを代謝的に3H 標識した。細胞を洗浄して、5 ug/ml のapoAI を90分作用させ、低張液で細胞を処理し、細胞質を得た。細胞質を1.175 g/ml の sucrose 溶液に重層して、49,000 rpm , 48 h 遠心した。これを12画分に分け、それぞれの画分より脂質を抽出し、TLC により分析した。微小管様フィラメントの再構成:細胞質画分に 100 uM GTP と 2 mM MgCl2 を加えて、室温で20分間インクベートした。これを、15,000 rpm ,30分間遠心沈澱を larger reconstituted microtubule-like filament とし、遠心上清をさらに 80,000 rpm 30分間の遠心し、その沈澱画分をshorter reconstituted filament とした。
(藤野)マウスApoE受容体2(ApoER2)遺伝子をジーンターゲッティング法により破壊し、ApoER2欠損マウスを作製した。また、VLDLR/ApoER2遺伝子を欠損したダブルノックアウト(DKO)マウス、更にApoE/VLDLR/ApoER2遺伝子を欠損するトリプルノックアウト(TKO)マウスを作製した。これらDKO及びTKOマウスを組織学及び生化学レベルで比較解析することにより、脳神経系におけるリポタンパク受容体とApoEの役割を解析した。さらに、ApoE、VLDLR、ApoER2又はLDLRをそれぞれ欠損したマウスを48時間絶食させ、脳内のタウ蛋白リン酸化状態を解析した。
(倫理面への配慮)
実験動物を用いる実験は、国立療養所中部病院動物実験倫理委員会、東北大学農学部動物実験倫理委員会および名古屋市立大学医学部倫理委員会の承認を受けて行われた。
(道川) 新生仔マウス(生後1-2日目)大脳皮質からのアストロサイト培養、得られた検体の脂質生化学的および生化学的解析は、既に報告した方法(Michikawa M. et al, J Neurosci, 2001)により行った。ラットアストロサイトの培養では、胎生期17日目のラット胎児脳より大脳を摘出し血管、髄膜除去、脳細片後、1% trypsin溶液で処理して10%FCS含有 F-10 培地で1週間培養し、primary cultureとした。この細胞を再度 1% trypsin溶液で処理し、ピペッティング後 6-well multitrayあるいは petri dish (直径 15cm)に播種し、1週間 secondary cultureし、実験に供した。脂質分析では、diacylglyceride (DG), cholesterol (Cho), sphingomyelin (SM), phosphatidylcholine (PC) 合成には3H-acetate を用い、TLCによって分析した。また培地中に分泌されるHDLの分析はsucroseで培地の密度を 1.2 - 1.007 g/ml に調整し、48時間 49,000 rpm で遠心し、各フラクションの密度と脂質分布を分析し密度 1.2 - 1.08 をHDL 画分とした。細胞内リポタンパクの分析:ラットアストロサイトに 40 uCi/ml の 3H-acetate を2時間取り込ませてコレステロールを代謝的に3H 標識した。細胞を洗浄して、5 ug/mlのapoAI を90分作用させ、低張液で細胞を処理し、300,000 x g, 30 min の超遠心で細胞質を得た。細胞質を1.175 g/ml の sucrose 溶液に重層して、49,000 rpm , 48 h 遠心した。これを12画分に分け、それぞれの画分より脂質を抽出し、TLC により分析した。
(伊藤)細胞質の調製:培養アストロサイトを 0.02M Tris-HCl buffer, pH 7.5, containing protease inhibitor (0.02M Tris) により回収し、5分間毎に20回強く撹拌し、これを3回くり返した。90,000 rpm で 30 分間遠心し、得られた上清を細胞質画分とした。培養ろ液の脂質分析:diacylglyceride (DG), cholesterol (Cho), sphingomyelin (SM), phosphatidylcholine (PC) 合成には3H-acetate を用い、TLCによって分析した。また培地中に分泌されるHDLの分析はsucroseで培地の密度を 1.2 - 1.007 g/ml に調整し、48時間 49,000 rpm で遠心し、各フラクションの密度と脂質分布を分析し密度 1.2 - 1.08 をHDL 画分とした。細胞内リポタンパクの分析:ラットアストロサイトに 40 uCi/ml の 3H-acetate を2時間取り込ませてコレステロールを代謝的に3H 標識した。細胞を洗浄して、5 ug/ml のapoAI を90分作用させ、低張液で細胞を処理し、細胞質を得た。細胞質を1.175 g/ml の sucrose 溶液に重層して、49,000 rpm , 48 h 遠心した。これを12画分に分け、それぞれの画分より脂質を抽出し、TLC により分析した。微小管様フィラメントの再構成:細胞質画分に 100 uM GTP と 2 mM MgCl2 を加えて、室温で20分間インクベートした。これを、15,000 rpm ,30分間遠心沈澱を larger reconstituted microtubule-like filament とし、遠心上清をさらに 80,000 rpm 30分間の遠心し、その沈澱画分をshorter reconstituted filament とした。
(藤野)マウスApoE受容体2(ApoER2)遺伝子をジーンターゲッティング法により破壊し、ApoER2欠損マウスを作製した。また、VLDLR/ApoER2遺伝子を欠損したダブルノックアウト(DKO)マウス、更にApoE/VLDLR/ApoER2遺伝子を欠損するトリプルノックアウト(TKO)マウスを作製した。これらDKO及びTKOマウスを組織学及び生化学レベルで比較解析することにより、脳神経系におけるリポタンパク受容体とApoEの役割を解析した。さらに、ApoE、VLDLR、ApoER2又はLDLRをそれぞれ欠損したマウスを48時間絶食させ、脳内のタウ蛋白リン酸化状態を解析した。
(倫理面への配慮)
実験動物を用いる実験は、国立療養所中部病院動物実験倫理委員会、東北大学農学部動物実験倫理委員会および名古屋市立大学医学部倫理委員会の承認を受けて行われた。
結果と考察
(道川)apoE-HDL は、神経細胞からコレステロールを引き抜くことが知られているが、その作用はapoE3-HDL>>apoE4-HDLであった。この違いのメカニズムを明らかにするために、人工的に作ったHDL様粒子(エマルジョン:EM)を用いてEM-apoE複合体を作り、apoEとEMとの結合比を様々に変えながら、EM-apoE複合体の神経細胞からのコレステロール引き抜き作用を検討した。その結果、(2) EMの引き抜き作用は、apoE分子と結合することによってその分子数依存的に抑制されることが明らかになった。(3)また、apoE4の方がapoE3に比べて脂質粒子に親和性が高く結合しやすいことが明らかになった。(4) ベータメルカプトエタノールでapoE3どうしの2量体結合を切断するとapoE3とapoE4のアイソフォーム依存性は消失した。apoE3-HDLおよびapoE4-HDLの神経細胞からのコレステロール搬出作用は、apoE3とapoE4の脂質粒子への親和性の違いによって説明がつくこと、その親和性の違いを生み出しているものがapoE3の持つシステインによる2量体形成であることが明らかになった。昨年度の研究から、apoE3はapoE4に比しコレステロール供給能に優れ、従ってコレステロール代謝恒常性維持により優れた能力を持つことを明らかにし、Aβ重合体による細胞内コレステロール量の低下に対して、apoEはHDLの新生によるHDLコレステロールの供給によってその恒常性維持に働くが、この能力にアイソフォーム依存性(apoE3>apoE4)があるために、apoE4ではより早期にコレステロール代謝の破綻と疾患発症を招く可能性を提示した。今年度の研究結果は、HDLと神経細胞膜間のコレステロール交換作用において、apoE3-HDLは、apoE4型に比べて圧倒的に強い作用を持つことが明らかになった。これは、加齢あるいはAβ重合体形成・濃度上昇に伴って増加する活性酸素産生によって増加する酸化コレステロールなどを新たなコレステロールと交換する能力がapoE3型の方が優れていることを示唆している。すなわち、apoE3型のアストロサイトは、apoE4型に比べてコレステロール供給のみならず、膜のコレステロール新陳代謝にも優れていることが考えられる。
(伊藤)アストロサイトを apoA-I で刺激すると5分後にSMやPCなどコリンホスホリピットに比べDGは特異的にその合成が促進された。U73122 によってDG産生を抑制すると、DG産生に加えて、Cho, SM などの脂質合成も抑制され、さらに細胞内コレステロール輸送、apoA-I によるコレステロール搬出も抑制された。また、U73433 はこれらの諸反応を抑制しなかった。これらの知見から、apoA-I 作用後の細胞内DG産生は apoA-I で誘導される細胞内コレステロール輸送およびコレステロール搬出に重要な役割をもつものと考えられる。apoA-I 刺激後5分で産生されるDGは細胞膜ではなく、細胞質リポタンパク画分において観察された。apoA-I 刺激後の細胞内 protein kinase Cαの分布を調べてみると、刺激後5分以降で細胞膜protein kinase Cαは減少し、細胞質のそれは増加した。また、細胞質に分布する phospholipase Cγ は apoA-I 刺激後5分で細胞質リポタンパク画分に移行した。このことから、apoA-I 作用後5分で、phospholipase Cγが何らかのシグナルにより細胞質リポタンパク画分に移行し、そこでDG産生が上昇するものと思われる.細胞質リポタンパク画分におけるDG産生の上昇と共に、protein kinase Cαもこの画分に移行した。U73122 はprotein kinase Cαの細胞質リポタンパク画分への移行を阻害した。また、細胞質リポタンパク画分へ移行したprotein kinase Cαはセリンリン酸化されていた。抗 caveolin-1 抗体で細胞質protein kinase Cαが免疫沈降し、また抗protein kinase Cα抗体でも caveolin-1 が沈降することから、細胞質リポタンパクにおいて、caveolin-1 と抗protein kinase Cαとが結合していることが示唆された。Protein kinase C 阻害剤は apoA-I で誘導される細胞内コレステロール輸送およびコレステロールの細胞外搬出のいずれもが抑制された。アストロサイトを apoA-I で5分間刺激すると、細胞質において caveolin-1 と protein kinase Cα, β-tubulin, β-actin との結合が増加した。これらの結合は caveolin-1 の scaffolding domain と同一の peptide により抑制された。また、caveolin-1 と protein kinase Cα の結合は 60 mM octylglycoside と 1% Triton X-100 を含む溶液によっても抑制されないことから、CLPP 上での間接的な結合ではなく、直接結合していることが示唆された。ApoA-I で5分間刺激されたアストロサイトの細胞質より微小管を再構成すると、caveolin-1 や protein kinase Cαは再構成フィラメントからも回収された。また、apoA-I で5分間刺激されたアストロサイトの細胞質をショ糖密度勾配の超遠心で分析すると、CLPP画分から回収される β-tubulin やβ-actin は増加した。これらの結果から、CLPP 画分におけるcaveolin-1 と protein kinase Cαは細胞骨格、特に微小管と密接に相互作用することが示唆された。
(藤野) LRP5欠損マウスは外見、行動、繁殖は正常で、組織学的にもほとんどの組織に異常は観察されなかった。唯一、頭頂骨と脛骨の骨密度の低下が観察され、また、グルコース刺激時においてラ氏島β細胞からのインスリン分泌不全を示した。これに伴ってラ氏島ではグルコース刺激による細胞内カルシウム及びATP産生の低下、グルコキナーゼ、IGF受容体及びIRS-2の発現低下が観察された。さらに、血中カイロミクロン(CM)のクリアランスの低下を示し、血中コレステロール濃度の上昇が観察された。アポE/LRP5遺伝子を欠損したダブルノックアウトマウスではさらに顕著で、著しい血中コレステロール濃度の上昇と動脈硬化巣形成の促進が観察された。新規HDL結合タンパク質はGPIアンカー型の膜タンパク質で、心臓に最も高く、次いで肝臓、肺に発現が認められた。また、本タンパク質はHDLに依存した細胞内への選択的コレステロール取り込みに関与する事が明らかとなった。KOマウスを用いた解析から、脳内におけるApoE受容体としてはVLDLRが主要な役割を果たしていること、ApoEは神経細胞の分化発生や移動及び配置決定に関わるシグナルを伝えている可能性が示唆された。また、ApoER2及びLDLRはタウ蛋白の高度リン酸化において重要な役割を果たしていることが示唆された。
(伊藤)アストロサイトを apoA-I で刺激すると5分後にSMやPCなどコリンホスホリピットに比べDGは特異的にその合成が促進された。U73122 によってDG産生を抑制すると、DG産生に加えて、Cho, SM などの脂質合成も抑制され、さらに細胞内コレステロール輸送、apoA-I によるコレステロール搬出も抑制された。また、U73433 はこれらの諸反応を抑制しなかった。これらの知見から、apoA-I 作用後の細胞内DG産生は apoA-I で誘導される細胞内コレステロール輸送およびコレステロール搬出に重要な役割をもつものと考えられる。apoA-I 刺激後5分で産生されるDGは細胞膜ではなく、細胞質リポタンパク画分において観察された。apoA-I 刺激後の細胞内 protein kinase Cαの分布を調べてみると、刺激後5分以降で細胞膜protein kinase Cαは減少し、細胞質のそれは増加した。また、細胞質に分布する phospholipase Cγ は apoA-I 刺激後5分で細胞質リポタンパク画分に移行した。このことから、apoA-I 作用後5分で、phospholipase Cγが何らかのシグナルにより細胞質リポタンパク画分に移行し、そこでDG産生が上昇するものと思われる.細胞質リポタンパク画分におけるDG産生の上昇と共に、protein kinase Cαもこの画分に移行した。U73122 はprotein kinase Cαの細胞質リポタンパク画分への移行を阻害した。また、細胞質リポタンパク画分へ移行したprotein kinase Cαはセリンリン酸化されていた。抗 caveolin-1 抗体で細胞質protein kinase Cαが免疫沈降し、また抗protein kinase Cα抗体でも caveolin-1 が沈降することから、細胞質リポタンパクにおいて、caveolin-1 と抗protein kinase Cαとが結合していることが示唆された。Protein kinase C 阻害剤は apoA-I で誘導される細胞内コレステロール輸送およびコレステロールの細胞外搬出のいずれもが抑制された。アストロサイトを apoA-I で5分間刺激すると、細胞質において caveolin-1 と protein kinase Cα, β-tubulin, β-actin との結合が増加した。これらの結合は caveolin-1 の scaffolding domain と同一の peptide により抑制された。また、caveolin-1 と protein kinase Cα の結合は 60 mM octylglycoside と 1% Triton X-100 を含む溶液によっても抑制されないことから、CLPP 上での間接的な結合ではなく、直接結合していることが示唆された。ApoA-I で5分間刺激されたアストロサイトの細胞質より微小管を再構成すると、caveolin-1 や protein kinase Cαは再構成フィラメントからも回収された。また、apoA-I で5分間刺激されたアストロサイトの細胞質をショ糖密度勾配の超遠心で分析すると、CLPP画分から回収される β-tubulin やβ-actin は増加した。これらの結果から、CLPP 画分におけるcaveolin-1 と protein kinase Cαは細胞骨格、特に微小管と密接に相互作用することが示唆された。
(藤野) LRP5欠損マウスは外見、行動、繁殖は正常で、組織学的にもほとんどの組織に異常は観察されなかった。唯一、頭頂骨と脛骨の骨密度の低下が観察され、また、グルコース刺激時においてラ氏島β細胞からのインスリン分泌不全を示した。これに伴ってラ氏島ではグルコース刺激による細胞内カルシウム及びATP産生の低下、グルコキナーゼ、IGF受容体及びIRS-2の発現低下が観察された。さらに、血中カイロミクロン(CM)のクリアランスの低下を示し、血中コレステロール濃度の上昇が観察された。アポE/LRP5遺伝子を欠損したダブルノックアウトマウスではさらに顕著で、著しい血中コレステロール濃度の上昇と動脈硬化巣形成の促進が観察された。新規HDL結合タンパク質はGPIアンカー型の膜タンパク質で、心臓に最も高く、次いで肝臓、肺に発現が認められた。また、本タンパク質はHDLに依存した細胞内への選択的コレステロール取り込みに関与する事が明らかとなった。KOマウスを用いた解析から、脳内におけるApoE受容体としてはVLDLRが主要な役割を果たしていること、ApoEは神経細胞の分化発生や移動及び配置決定に関わるシグナルを伝えている可能性が示唆された。また、ApoER2及びLDLRはタウ蛋白の高度リン酸化において重要な役割を果たしていることが示唆された。
結論
公開日・更新日
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