文献情報
文献番号
200200835A
報告書区分
総括
研究課題名
ヒト型重症心不全の作成と遺伝子・再生医療特許の実用化(統括研究報告書)
課題番号
-
研究年度
平成14(2002)年度
研究代表者(所属機関)
豊岡 照彦(東京大学)
研究分担者(所属機関)
- 倉地幸徳(産業技術総合研究所)
- 小澤敬也(自治医科大学)
- 仲澤幹雄(新潟大学)
- 河田登美枝(新潟大学)
- 川口秀明(北海道大学)
- 徳永勝士(東京大学)
- 重松宏(東京大学)
- 上原誉志男(東京大学)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 先端的厚生科学研究分野 基礎研究成果の臨床応用推進研究
研究開始年度
平成14(2002)年度
研究終了予定年度
-
研究費
60,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
拡張型心筋症は循環器疾患の中で難治性の重症心不全を来し、心移植が根本治療と目される。心移植は未だ社会的にも医療面でも究極の治療から程遠く代替治療法の開発が望まれる。本研究では遺伝子と再生医療を併用した新たな治療法を開発する事を統一目標として上記9グループで分担研究した。rAAVベクターによる治療効果を改善させる為に新たなrAAVと長期間遺伝子発現可能な治療用発現ベクターを開発する(小澤、倉地)。筋障害の発症とcalpainとの関係を明らかにし(川口)、先天性の遺伝子欠損と後天性心不全が重症化する機構を検討して(河田、仲澤)、冠動脈再狭窄が心不全を増悪させる機構を解明する(重松)。多数検体を簡便、正確かつ低コストのタイピング法を徳永が確立し、上原が遺伝的負荷要因を集団検診結果に基付いて解析する。これらの研究結果を統合して重症心不全の心移植に代わる医療開発を豊岡が目指す。
研究方法
小澤;2型を改良した1-5型のrAAVベクターを作製して骨格筋へのtransfection効率を検討した。倉地;ヒト血液凝固第IX因子及びプロテインCの年齢軸遺伝子発現調節機構をプロモーター解析した。川口;calpainの筋細胞膜構成蛋白に対する作用をヒト培養骨格筋細胞を用いてCa2+イオノフォアで細胞内Ca2+濃度を上昇させてα-SGについてWestern blottingにより解析した。この時、calpain阻害薬の作用も検討した。仲澤;同グループが開発した自己免疫性心筋炎後の心不全モデルラットを用いて細胞膜と可溶性画分の構成蛋白の泳動パターンと発現量を2次元解析した。河田;心筋症発症ハムスターのTO-2と正常対照のF1B系を用いて両心カテーテル検査により血行動態測定後に細胞膜非透過性の蛍光色素(EB)を静注してジストロフィンおよびδ-SG特異抗体による二重蛍光観察により蛋白発現とin situの心筋細胞膜の透過性を同時に検出した。同時に遺伝子治療効果を確認した。重松;豊岡らが既にin vitroで報告した1型IP3受容体(IP3-R1)のhetero knockoutマウスを東大、医科学研究所より供与頂き、重松らが新たに開発した頚動脈処理を加え、28日後に組織学的に検討した。徳永;大規模SNPタイピング法として特異的伸長反応と一分子蛍光検出法を併用した高感度測定を確立した。上原;遺伝的素因の強い心筋症の原因遺伝子について当研究室から報告した候補遺伝子の発現頻度を臨床活用する。効率的に対象者をスクリーニングする前向きの予後追跡調査をSSCPとdirect sequencingにより遺伝子解析を行う。豊岡;心不全の新たな治療法を確立する為に、以下の4研究を実施する。①心不全の重症化機構とジストロフィンとの関連を心機能検査、ジストロフィン特異抗体と蛍光色素による心筋組織学的観測、②これに及ぼす遺伝子治療効果の確認、③骨格筋芽細胞移植による心不全治療を同種間皮膚移植、筋芽細胞の骨格筋と心筋に移植により予備検討する、④RNAiによる心不全増悪因子の発現抑制を骨格筋細胞株により検討する。
結果と考察
小澤;レポーター遺伝子をCMVプロモーターで駆動して従来の2型に比較して1と5型は骨格筋に効率よく発現した。今後1と5型 rAAVを用いて遺伝子治療を進める。倉地;ヒト血液凝固第IX因子及びプロテインCのプロモーター解析を行い、遺伝子エレメントASEとAIEが遺伝子発現を増強する事を明らかにした。川口;骨格筋細胞で対照実験と比較して、細胞内Ca2+濃度を上昇させた場合、α-SGの発現量が約30%低下した。この時calpainの阻害薬のleupeptin添加により、その減少は完全に阻止された。仲澤;
二次元画像解析の結果、心不全モデルラットの可溶性画分では43%のスポットに増減が認められ、一方膜画分では40%に増減が認められた。膜画分で減少したスポット数が多く、可溶性画分への蛋白の移動を示唆する。河田;TO-2では正常のF1Bに比べ収縮能が初期から低下し、後期に鬱血性心不全を呈した。両群の心筋組織をジストロフィン抗体、δ-SG抗体による免疫染色と細胞膜非透過性のEBによる二重蛍光観察を行い、蛋白発現とin situの膜透過性を同時検出した結果DCMの重症化に伴い、ジストロフィンが崩壊して細胞膜から解離し、細胞質に移行(translocate)して、膜透過性が増加した。更に遺伝子治療によりδ-SG遺伝子が発現した細胞で膜機能が正常化した。重松;本研究では血管内膜肥厚に着目し、IP3-R1と内膜肥厚の関連を検討する為にIP3-R1 hetero knockoutと対照マウスに頚動脈処理を加えた。28日後のNeointima area/ media area比はknockoutマウス群で有意に抑制された。徳永;PCR産物を蛍光解析して遺伝子型を決定し、更に大量SNPタイピングシステムの確立に成功した。上原;遺伝子診断システムの確立を目標として各種臨床検査から心筋症は0.2%程度に検出された。この中に既に発表した責任遺伝子の中で、ミトコンドリア遺伝子異常を有する者が相当数含まれていた。豊岡;同研究室で得られた成果を箇条書きする。①心不全の重症化機構の解明。分担研究者と協力して正常のF1B系とDCM発症TO-2系ハムスターを用い、心機能を比較した結果、全週齢で収縮能が悪化し、更に生後25-40週目から鬱血状態が加わった。血行動態測定後にジストロフィンの特異抗体とEBを用いて二重蛍光観測法で観測した結果、心機能の悪化に伴い、ジストロフィンは細胞膜から細胞質に移行し、細胞膜透過性が亢進していた。更にジストロフィンのWestern blottingにより幼若期には正常動物と同様のバンドのみ認めたが、週齢に従いジストロフィンが分解し、断片化した。②rAAVによる遺伝子治療。長期遺伝子発現可能なrAAVにより正常配列のδ-SG遺伝子を発現して、ジストロフィンの変性と細胞膜の変性は防止可能だった(Kawada et al., PNAS, 2002)。③細胞移植による心不全治療。F1Bの皮膚をTO-2に移植して4週目に生着し、病理学的にも拒絶反応を認めなかった。また大腿筋より筋芽細胞を単離して組織培養・増幅後にTO-2の骨格筋に移植して筋芽細胞も骨格筋に生着した。次に開胸手術下に左室心筋層に筋芽細胞を移植して4週目にδ-SG抗体で免疫染色した結果、TO-2の心筋の中にF1B由来のδ-SG蛋白陽性の心筋に分化した細胞集団を認めた。④RNAiによる心不全増悪因子の発現抑制。現段階で未だ原因遺伝子が特定されない症例について増悪因子を減弱させる「対症的遺伝子治療」でも心機能が改善すると報告されている。当研究室では心筋細胞内因性のcalpainが増悪させる傍証を得た(Toyo-oka et al., BBRC, 1978; Toyo-oka et al., Am.J.Physiol., 1981)。antisense DNAを用いて発現抑制を試みたが不十分な結果だった(Chen et al., J.Biol.Chem, 2000; Wang et al., Circulation 2001)。今後更に強力なRNAiにより遺伝子発現を抑制して治療に供する予定であり、その予備実験のin vitro実験系で基礎データを得た(Abe et al., Am.J.Physiol., in press)。⑤サルによる心不全状態の作製。国立感染症研究所付属、霊長類共同利用施設に公募したが、締切り後だったため平成15年度に再応募している。
二次元画像解析の結果、心不全モデルラットの可溶性画分では43%のスポットに増減が認められ、一方膜画分では40%に増減が認められた。膜画分で減少したスポット数が多く、可溶性画分への蛋白の移動を示唆する。河田;TO-2では正常のF1Bに比べ収縮能が初期から低下し、後期に鬱血性心不全を呈した。両群の心筋組織をジストロフィン抗体、δ-SG抗体による免疫染色と細胞膜非透過性のEBによる二重蛍光観察を行い、蛋白発現とin situの膜透過性を同時検出した結果DCMの重症化に伴い、ジストロフィンが崩壊して細胞膜から解離し、細胞質に移行(translocate)して、膜透過性が増加した。更に遺伝子治療によりδ-SG遺伝子が発現した細胞で膜機能が正常化した。重松;本研究では血管内膜肥厚に着目し、IP3-R1と内膜肥厚の関連を検討する為にIP3-R1 hetero knockoutと対照マウスに頚動脈処理を加えた。28日後のNeointima area/ media area比はknockoutマウス群で有意に抑制された。徳永;PCR産物を蛍光解析して遺伝子型を決定し、更に大量SNPタイピングシステムの確立に成功した。上原;遺伝子診断システムの確立を目標として各種臨床検査から心筋症は0.2%程度に検出された。この中に既に発表した責任遺伝子の中で、ミトコンドリア遺伝子異常を有する者が相当数含まれていた。豊岡;同研究室で得られた成果を箇条書きする。①心不全の重症化機構の解明。分担研究者と協力して正常のF1B系とDCM発症TO-2系ハムスターを用い、心機能を比較した結果、全週齢で収縮能が悪化し、更に生後25-40週目から鬱血状態が加わった。血行動態測定後にジストロフィンの特異抗体とEBを用いて二重蛍光観測法で観測した結果、心機能の悪化に伴い、ジストロフィンは細胞膜から細胞質に移行し、細胞膜透過性が亢進していた。更にジストロフィンのWestern blottingにより幼若期には正常動物と同様のバンドのみ認めたが、週齢に従いジストロフィンが分解し、断片化した。②rAAVによる遺伝子治療。長期遺伝子発現可能なrAAVにより正常配列のδ-SG遺伝子を発現して、ジストロフィンの変性と細胞膜の変性は防止可能だった(Kawada et al., PNAS, 2002)。③細胞移植による心不全治療。F1Bの皮膚をTO-2に移植して4週目に生着し、病理学的にも拒絶反応を認めなかった。また大腿筋より筋芽細胞を単離して組織培養・増幅後にTO-2の骨格筋に移植して筋芽細胞も骨格筋に生着した。次に開胸手術下に左室心筋層に筋芽細胞を移植して4週目にδ-SG抗体で免疫染色した結果、TO-2の心筋の中にF1B由来のδ-SG蛋白陽性の心筋に分化した細胞集団を認めた。④RNAiによる心不全増悪因子の発現抑制。現段階で未だ原因遺伝子が特定されない症例について増悪因子を減弱させる「対症的遺伝子治療」でも心機能が改善すると報告されている。当研究室では心筋細胞内因性のcalpainが増悪させる傍証を得た(Toyo-oka et al., BBRC, 1978; Toyo-oka et al., Am.J.Physiol., 1981)。antisense DNAを用いて発現抑制を試みたが不十分な結果だった(Chen et al., J.Biol.Chem, 2000; Wang et al., Circulation 2001)。今後更に強力なRNAiにより遺伝子発現を抑制して治療に供する予定であり、その予備実験のin vitro実験系で基礎データを得た(Abe et al., Am.J.Physiol., in press)。⑤サルによる心不全状態の作製。国立感染症研究所付属、霊長類共同利用施設に公募したが、締切り後だったため平成15年度に再応募している。
結論
治療用ベクターの改善と大量生産を目指しパッケージング細胞株やバキュロウイルスを用いた新方法を検討する。更に治療年齢軸で安定化した至適遺伝子治療用ベクターの共同開発を図る。また細胞内Ca2+濃度の上昇に伴うα-SGの分解亢進現象はcalpainによる可能性が示唆された。プロテオーム解析も心筋細胞のリモデリングに際して膜画分から可溶性画分へ多くのタンパク質が移行し、これらの蛋白の同定が今後の課題である。これは蛋白発現とin situの膜透過性を同時検出した結果、DCMの重症化に伴いジストロフィンが崩壊して膜から細胞質に移行して、膜透過性が増加した結果と一致する。遺伝子治療により細胞膜機
能が改善した点から、その効果が再確認された。次にIP3-R1が血管内膜肥厚への関与は今後の治療戦略に大きく寄与する。更に徳永の一分子蛍光検出法は溶液中で測定可能な事に加えて、極微量の溶液で短時間で測定し得る事はの大きな利点である。心筋症疑いの患者について原因遺伝子を効率的に同定する為に臨床所見と遺伝子異常を関連づける。更に心不全の増悪、ジストロフィンの移行現象は蛋白分解酵素による限定分解を示唆し、イソプロテレノール過剰投与による急性心不全でも同様所見が認められ、心不全に共通した病態である(Xi et al., J.Cardiovasc.Pharmacol., 2000)。以上の結果は「DCMの重症化はδ-SG遺伝子の欠損が一義的に起こすのではなく、ジストロフィンの二次的な崩壊による細胞変性の結果」と考える我々の仮説を支持する。また同種間で骨格筋が心筋に分化生着する事実は今後の細胞移植に大きな期待を与える。現在国立感染症研究所、霊長類共同利用施設から最優先で御協力頂ける承諾を頂いている。またペースメーカーによる頻脈刺激はサルに於いても再現性良く心不全状態を作製可能な事が報告された事から平成15年度はこのモデルで心不全を作製して各種生理、生化学的検査を実施する予定である。
能が改善した点から、その効果が再確認された。次にIP3-R1が血管内膜肥厚への関与は今後の治療戦略に大きく寄与する。更に徳永の一分子蛍光検出法は溶液中で測定可能な事に加えて、極微量の溶液で短時間で測定し得る事はの大きな利点である。心筋症疑いの患者について原因遺伝子を効率的に同定する為に臨床所見と遺伝子異常を関連づける。更に心不全の増悪、ジストロフィンの移行現象は蛋白分解酵素による限定分解を示唆し、イソプロテレノール過剰投与による急性心不全でも同様所見が認められ、心不全に共通した病態である(Xi et al., J.Cardiovasc.Pharmacol., 2000)。以上の結果は「DCMの重症化はδ-SG遺伝子の欠損が一義的に起こすのではなく、ジストロフィンの二次的な崩壊による細胞変性の結果」と考える我々の仮説を支持する。また同種間で骨格筋が心筋に分化生着する事実は今後の細胞移植に大きな期待を与える。現在国立感染症研究所、霊長類共同利用施設から最優先で御協力頂ける承諾を頂いている。またペースメーカーによる頻脈刺激はサルに於いても再現性良く心不全状態を作製可能な事が報告された事から平成15年度はこのモデルで心不全を作製して各種生理、生化学的検査を実施する予定である。
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