文献情報
文献番号
200200590A
報告書区分
総括
研究課題名
赤痢アメーバ症等寄生虫症ハイリスク群に対する予防法等の開発に関する研究(総括研究報告書)
課題番号
-
研究年度
平成14(2002)年度
研究代表者(所属機関)
竹内 勤(慶応義塾大学医学部)
研究分担者(所属機関)
- 橘 裕司(東海大学医学部)
- 牧岡朝夫(東京慈恵会医科大学)
- 野崎智義(国立感染症研究所)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 先端的厚生科学研究分野 新興・再興感染症研究
研究開始年度
平成14(2002)年度
研究終了予定年度
平成16(2004)年度
研究費
27,600,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
わが国のアメーバ症の疫学的状況に鑑み、以下の目的を以て研究を行なう。 ・ハイリスク集団のうち施設におけるアメーバ感染の実態を明らかにし、制圧対策モデル化と実施、及び感染予防ガイドライン作成、試行を行なう。 ・E. dispar無菌培養系の確立を行なう。 ・免疫診断法を改良する。 ・サブポピュレーション同定法を開発し、迅速化・応用を計る. ・アメーバ表面レクチンをワクチンとして評価する. ・薬剤による感染予防法開発のため標的およびその阻害剤を探索する。
研究方法
〈1)施設内アメーバ感染の実態の把握と制圧:調査はE. histolytica ・ kit、Tech Lab)を含む糞便検査、 ELISÅ等による血清検査を併用して行った。陽性者があった場合は施設側で集団治療を行い、フォローアップは本研究班で実施した。また感染予防ガイドラインの改訂を行なった。迅速モニタリング法として上記キットの導入も試みた。また分離株のvirulenceを調ペるため蛍光顕微鏡下で標的細胞死をリアルタイムで捉える試みも行なった。;(2)免疫診断法の開発:E. histolyticaとE. disparの150-kDaレクチン遺伝子のクローニングを行い.塩基配列の差異を調ペ鑑別の可能性を検索した。E.disparの無菌培養ではYIGADHA-S mediumと植物由来の増殖促進物質との組合せを検討し,最適系の開発を試みた。また今年度はculture associateを除去し,YIGADHA-S mediumにどの程度適応するか検索した。;(3)アメーバ感染予防法の開発:上記150-kDaのレクチンの組み替え蛋白を作成し、エピトープの局在やモノクロナル抗体を使用して抗原性を調べた。;(4)サブポピュレーション特定化の方法の開発:これまでに開発した同定法を用いてタイ等の分離株と国内分離株の比較を行なった。また解析法の迅速化のため、PCRにて上記の方法で増幅されたSREHPの断片を制限酵素で処理しアガロースゲル電気泳動にてパターンを調ペ、遺伝子の多形性が確認できるか調査した. ; (5)新規薬剤による感染予防法開発:モデルとしてE. invadensを使用しin vitroで嚢子形成、脱嚢阻害剤を検索した。また新しい薬剤標的として細胞内情報伝達に重要なファルネシル転移酵素(FT)に注目し、その遺伝子をクローニングし、組み替え蛋白を作成して性状を高等動物と比較した。
倫理面への配慮:施設利用者の家族には説明を行い同意を得た。今後の疫学調査については担当施設の倫理委員会に申請し、現在修正中であり、近々認可の見込みである。
倫理面への配慮:施設利用者の家族には説明を行い同意を得た。今後の疫学調査については担当施設の倫理委員会に申請し、現在修正中であり、近々認可の見込みである。
結果と考察
結果
(1)ハイリスク集団におけるアメーバ感染の実態把握と制圧対策確立:追跡調査の対象である1施設では新感染はなかった。集団治療、その後の予防対策が奏効したと思われる。また感染予防ガイドラインを今年度改訂した。今回新しく調査に入ったのは1施設で、 ELISAで67.1%、抗原定量を含む糞便検査で27.6%と云う陽性率が示された。この施設では集団治療を行なったが陽性者が検出されており、今後モニタリングを継続する。またこの施設での分離株に関して本研究班が開発した多型性解析を応用したところ、この施設と昨年度調査した1施設の計2施設における株は1987年の神奈川でのわが国最初の施設内感染事例と同じパターンを持つことが判明した。神奈川からの転園者が7年前にこの両施設に入っている事も確認された。迅速診断法の導入についてはE. histolytica ・ kit (Tech Lab)を選定し、既に1施設にて説明を行い同意を得た。 Ethidium homodimerによるvirulenceの測定はCHO細胞を標的として行なったが、アメーバの標的細胞への接着後の細胞死が確認できた。この方法によりリアルタイムでvirulence解析が可能となった。;(2)アメーバの免疫学的同定法の開発:E. disparの無菌培養系の作成では5株をYIGADHA-S mediumで完全無菌培養化することに成功した。診断への応用のためE. dispar150-kDaレクチン遺伝子をクローニングしたが、これはE. histolyticaと72～73%の相同性を示した。これにより150-kDaのレクチンが免疫診断に応用可能と推定された。;(3)アメーバ感染予防法の開発:ワクチン候補としての150-kDa表面レクチンの検討で、全長と様々な部分の組み替え蛋白質を作成して、各種抗体との反応性を調べた。その結果全長が最も反応性が高く、次いでC未部であった。またアメーバの細胞接着を阻害するモノクロナル抗体と組み替え蛋白質を用いて反応性を調ペ、モノクロナル抗体のうちmAb2、mAb3のエピトープの局在を決定する事ができた。;(4)サブポピュレーションの同定方法の開発と応用:確立した方法によりタイ等とわが国の分離株の比較を試みた。その結果差異は大きく、最もパターンが異なっていたのはSREHPであった。この事からSREHPを標的とした迅速多型性同定法の作成が可能と思われた。このため増幅されたSREHP遺伝子断片を制限酵素処理の後にアガロースゲル電気泳動を行なって多型性解析を試みた。その結果この方法はシークエンシングの70%程度の能率を示した。;(5)新規薬剤による感染予防法開発:E. invadensをモデルとした嚢子形成・脱嚢阻害の解析を行なった結果、 oryzalin等が強く阻害することが明らかになった。また標的の探索範囲を拡大して、ファルネシル化を触媒するファルネシル転移酵素(FT)の性状の検討を試みた。組み替え蛋白質の性状を比較検討した結果、アメーバのFTα、 FTβはヒトのFTα、 FTβとは阻害剤、基質に差異がある事が判明した。
考察
本研究の成果は衛生行政上、アメーバ感染が重要である事を示している。 今回は集団治療、予防対策を行ない継続調査している1施設のフォローアップ、及び予防ガイドラインの改訂を試みた。また他施設では新感染が拡大しており、集団治療が1回では十分でなかった事も判明した。現在本研究班は地方自治体の衛研と協力体制を構築しながら、実態解明を行ないたいと考えている。また殆どの感染者が無症状である云う事実を検証するのに興味あるE. histolytica分離株が今年度得られた。更に昨年開発した遺伝子多型解析技術を応用して、活動性の感染が起こっている上記施設等での分離株が1987年神奈川でのアウトブレイクに由来しており、7年前に神奈川の施設より当該施設に移ってきた利用者がいることから、 7年間で高い感染率を示すまでになったことを示した。E. histolytica・kitの有用性に鑑み、施設の職員でも確実に実施できるように準備を整えつつある。
E. dispar無菌培養系の作成等でも展開が見られた。特に5株のE. dispar完全無菌培養株は広<応用されるものと期待される。サブポピュレーションの同定法も簡易化の手がかりを得つつあり、またわが国における最近のアメーバ感染者の増加がタイなど東南アジアからの流入によるものではない事が示唆された。アメーバ表面レクチンの検討も遺伝子レベルに及び、診断への応用も期待される。また今年度の成果はワクチン候補としてこのレクチンを評価するのに意義を有する。脱嚢等を標的にした予防法開発のための阻害剤の研究は幾つかの化合物の特徴を明らかにした。また更にファルネシル転移酵素の検索を行い、薬剤の標的となりうる事を示した。今後リード化合物としての可能性を検討したい。
(1)ハイリスク集団におけるアメーバ感染の実態把握と制圧対策確立:追跡調査の対象である1施設では新感染はなかった。集団治療、その後の予防対策が奏効したと思われる。また感染予防ガイドラインを今年度改訂した。今回新しく調査に入ったのは1施設で、 ELISAで67.1%、抗原定量を含む糞便検査で27.6%と云う陽性率が示された。この施設では集団治療を行なったが陽性者が検出されており、今後モニタリングを継続する。またこの施設での分離株に関して本研究班が開発した多型性解析を応用したところ、この施設と昨年度調査した1施設の計2施設における株は1987年の神奈川でのわが国最初の施設内感染事例と同じパターンを持つことが判明した。神奈川からの転園者が7年前にこの両施設に入っている事も確認された。迅速診断法の導入についてはE. histolytica ・ kit (Tech Lab)を選定し、既に1施設にて説明を行い同意を得た。 Ethidium homodimerによるvirulenceの測定はCHO細胞を標的として行なったが、アメーバの標的細胞への接着後の細胞死が確認できた。この方法によりリアルタイムでvirulence解析が可能となった。;(2)アメーバの免疫学的同定法の開発:E. disparの無菌培養系の作成では5株をYIGADHA-S mediumで完全無菌培養化することに成功した。診断への応用のためE. dispar150-kDaレクチン遺伝子をクローニングしたが、これはE. histolyticaと72～73%の相同性を示した。これにより150-kDaのレクチンが免疫診断に応用可能と推定された。;(3)アメーバ感染予防法の開発:ワクチン候補としての150-kDa表面レクチンの検討で、全長と様々な部分の組み替え蛋白質を作成して、各種抗体との反応性を調べた。その結果全長が最も反応性が高く、次いでC未部であった。またアメーバの細胞接着を阻害するモノクロナル抗体と組み替え蛋白質を用いて反応性を調ペ、モノクロナル抗体のうちmAb2、mAb3のエピトープの局在を決定する事ができた。;(4)サブポピュレーションの同定方法の開発と応用:確立した方法によりタイ等とわが国の分離株の比較を試みた。その結果差異は大きく、最もパターンが異なっていたのはSREHPであった。この事からSREHPを標的とした迅速多型性同定法の作成が可能と思われた。このため増幅されたSREHP遺伝子断片を制限酵素処理の後にアガロースゲル電気泳動を行なって多型性解析を試みた。その結果この方法はシークエンシングの70%程度の能率を示した。;(5)新規薬剤による感染予防法開発:E. invadensをモデルとした嚢子形成・脱嚢阻害の解析を行なった結果、 oryzalin等が強く阻害することが明らかになった。また標的の探索範囲を拡大して、ファルネシル化を触媒するファルネシル転移酵素(FT)の性状の検討を試みた。組み替え蛋白質の性状を比較検討した結果、アメーバのFTα、 FTβはヒトのFTα、 FTβとは阻害剤、基質に差異がある事が判明した。
考察
本研究の成果は衛生行政上、アメーバ感染が重要である事を示している。 今回は集団治療、予防対策を行ない継続調査している1施設のフォローアップ、及び予防ガイドラインの改訂を試みた。また他施設では新感染が拡大しており、集団治療が1回では十分でなかった事も判明した。現在本研究班は地方自治体の衛研と協力体制を構築しながら、実態解明を行ないたいと考えている。また殆どの感染者が無症状である云う事実を検証するのに興味あるE. histolytica分離株が今年度得られた。更に昨年開発した遺伝子多型解析技術を応用して、活動性の感染が起こっている上記施設等での分離株が1987年神奈川でのアウトブレイクに由来しており、7年前に神奈川の施設より当該施設に移ってきた利用者がいることから、 7年間で高い感染率を示すまでになったことを示した。E. histolytica・kitの有用性に鑑み、施設の職員でも確実に実施できるように準備を整えつつある。
E. dispar無菌培養系の作成等でも展開が見られた。特に5株のE. dispar完全無菌培養株は広<応用されるものと期待される。サブポピュレーションの同定法も簡易化の手がかりを得つつあり、またわが国における最近のアメーバ感染者の増加がタイなど東南アジアからの流入によるものではない事が示唆された。アメーバ表面レクチンの検討も遺伝子レベルに及び、診断への応用も期待される。また今年度の成果はワクチン候補としてこのレクチンを評価するのに意義を有する。脱嚢等を標的にした予防法開発のための阻害剤の研究は幾つかの化合物の特徴を明らかにした。また更にファルネシル転移酵素の検索を行い、薬剤の標的となりうる事を示した。今後リード化合物としての可能性を検討したい。
結論
施設でも集団治療、感染予防策の実施によってアメーバの新感染を抑圧できることが明らかになった。予防ガイドラインも改訂された。今後の衛生行政に寄与すると思われる。抗原定量キットの試験的導入も近々予定されており、感染抑圧あるいは予防対策確立のための基礎・応用研究も進展を見せた。
公開日・更新日
公開日
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更新日
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