文献情報
文献番号
200200443A
報告書区分
総括
研究課題名
腸上皮化生をモデルとしたマスター遺伝子制御による組織分化の研究(総括研究報告書)
課題番号
-
研究年度
平成14(2002)年度
研究代表者(所属機関)
牛島 俊和(国立がんセンター研究所)
研究分担者(所属機関)
- 立松正衛(愛知がんセンター研究所)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 総合的プロジェクト研究分野 ヒトゲノム・再生医療等研究（ヒトゲノム分野）
研究開始年度
平成12(2000)年度
研究終了予定年度
平成14(2002)年度
研究費
30,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
ゲノムのCpGメチル化は、DNA複製に際して保存され、遺伝子発現調節に重要な役割を果たす。個体発生過程においては、緻密な制御により各組織に特異的なメチル化のパターンが形成される。これらの事実から、メチル化は組織分化の制御と維持に重要な役割を果たしていると考えられている。本研究では、胃粘膜が腸粘膜への異常な分化を示す腸上皮化生をモデルとして、多クローナルな疾患においてもメチル化の異常が存在するのかを明らかにし、また、メチル化の異常についてのゲノム網羅的な探索により、分化異常のマスター遺伝子を同定することを目的とした。
研究方法
ヒト胃がんの手術材料から、幽門部と胃体部をそれぞれ切除、上皮のみを分離・収集した。エタノール固定後、Alcian blue染色を行い、腸上皮化生のある腺管とない腺管とを区別した。
第一回目のMSRDAでは、個体間の多型を分離することを避けるため、腸上皮化生が強い幽門腺と、腸上皮化生が少ない胃底腺とを用いて、MS-RDAを行った。MS-RDAにより得られたクローンについて、塩基配列を決定、ヒトゲノムドラフト配列を利用して、近傍のCpGアイランド及び遺伝子を検索した。
遺伝子発現解析は、Real-Time PCR装置を用いて、定量的RT-PCRにより行った。メチル化状態の解析は、bisulfiteシークエンス法、及び、methylation-specific PCR (MSP)法により行った。
遺伝子導入は、CMVプロモーター下流に目的遺伝子をsense及びantisense方向に連結し、胃がん細胞株に、リポソーム法及びエレクトロポレーション法によりトランスフェクションを行った。
第一回目のMSRDAでは、個体間の多型を分離することを避けるため、腸上皮化生が強い幽門腺と、腸上皮化生が少ない胃底腺とを用いて、MS-RDAを行った。MS-RDAにより得られたクローンについて、塩基配列を決定、ヒトゲノムドラフト配列を利用して、近傍のCpGアイランド及び遺伝子を検索した。
遺伝子発現解析は、Real-Time PCR装置を用いて、定量的RT-PCRにより行った。メチル化状態の解析は、bisulfiteシークエンス法、及び、methylation-specific PCR (MSP)法により行った。
遺伝子導入は、CMVプロモーター下流に目的遺伝子をsense及びantisense方向に連結し、胃がん細胞株に、リポソーム法及びエレクトロポレーション法によりトランスフェクションを行った。
結果と考察
【新規のMS-RDA】 昨年度までの結果に基づき、以下の改良をMS-RDAに加えた。・幽門腺と胃底腺とで、かなりメチル化状態が異なる。従って、同一症例由来の材料でなくても、腸上皮化生が強い幽門腺と、腸上皮化生がほとんどない幽門腺とを用いた。・プロモーター領域のCpGアイランドを同定する必要があり、それ以外のCpGアイランドは解析の優先度を下げた。・プロモーター領謔フCpGアイランドを同定するため、使用する制限酵素の種類を増やし、PCRに際してbetaineを添加するなど、MS-RDA法を改良した。現在まで解析が終了した16個のクローンのうち、7個がCpGアイランドに由来し、メチル化状態を検討した2個のCpGアイランド(非プロモーター領域)については、両方とも、腸上皮化生の出現に伴い、特異的にメチル化されていた。
【CDX1及びCDX2のメチル化解析】 ホメオボックス遺伝子CDX1及びCDX2は、正常な胃では発現しないが、腸上皮化生をもつ胃粘膜では発現誘導が認められる。Cdx2トランスジェニックマウスで胃の腸上皮化生が認められることから、腸形質発現のためのマスター遺伝子であると考えられている。
腸上皮化生をもたない正常胃粘膜と、腸上皮化生が強い胃粘膜とを用いて、CDX1のプロモーター領域CpGアイランド、及び、CDX2の5'上流域のメチル化を解析した。Bisulfite法により、各CpG部位のメチル化を検討したが、両遺伝子が発現していない正常な胃特異的なメチル化は、全く認められなかった。
【SOX2遺伝子の発現低下とメチル化】 SOX2遺伝子は、ニワトリで上部消化管での発現が知られるホメオボックス遺伝子である。ヒト正常消化管での発現を検討し、胃では発現し、小腸、大腸では発現しないことを見出した。次に、同一個体から腺管分離法により得られた腸上皮化生を示す幽門部腺管(腸上皮化生腺管)と腸上皮化生を示さない幽門部腺管(非腸上皮化生腺管)10組について、SOX2遺伝子発現を検討した。腸上皮化生腺管では、非腸上皮化生腺管に比べ、明らかにSOX2遺伝子の発現が低下していた。今後、この発現低下が、胃形質の消失につながるか否かを明らかにするため、SOX2を発現し、かつ、胃形質を保持する細胞でのノックダウンの実験、または、マウスでのコンディショナルなノックアウトの実験が必要である。
更に、SOX2遺伝子の発現低下におけるDNAメチル化の関与を検討するため、SOX2のエクソン1のCpGアイランドのメチル化状態を解析した。一つの腸上皮化生腺管の中にも、胃型の形質をもつ細胞も残存するため、定量的methylation-specific PCRにより、メチル化されたDNA分子の割合を定量した。その結果、腸上皮化生の発生に伴い、SOX2遺伝子のメチル化が出現することが確認された。さらに、その後明らかになったプロモーター領域と思われるCpGアイランドについてもメチル化解析を行ったが、こちらにはメチル化は認めなかった。
【多クローナルな疾患でのメチル化異常】 本研究により、腸上皮化生の様な多クローナルな疾患でも、CpGアイランドのメチル化の変化が存在することが明らかになった。SIM2のイントロン2領域のCpGアイランド、CpGアイランド#15, #19、SOX2のエクソン1のCpGアイランドなどが相当する。従って、複数の幹細胞において、同一のCpGアイランドのメチル化状態が変化していると考えられた。しかし、これらのCpGアイランドは遺伝子プロモーター領域には由来せず、遺伝子発現をサイレンシングの原因となるメチル化変化とは考えにくかった。
【CDX1及びCDX2のメチル化解析】 ホメオボックス遺伝子CDX1及びCDX2は、正常な胃では発現しないが、腸上皮化生をもつ胃粘膜では発現誘導が認められる。Cdx2トランスジェニックマウスで胃の腸上皮化生が認められることから、腸形質発現のためのマスター遺伝子であると考えられている。
腸上皮化生をもたない正常胃粘膜と、腸上皮化生が強い胃粘膜とを用いて、CDX1のプロモーター領域CpGアイランド、及び、CDX2の5'上流域のメチル化を解析した。Bisulfite法により、各CpG部位のメチル化を検討したが、両遺伝子が発現していない正常な胃特異的なメチル化は、全く認められなかった。
【SOX2遺伝子の発現低下とメチル化】 SOX2遺伝子は、ニワトリで上部消化管での発現が知られるホメオボックス遺伝子である。ヒト正常消化管での発現を検討し、胃では発現し、小腸、大腸では発現しないことを見出した。次に、同一個体から腺管分離法により得られた腸上皮化生を示す幽門部腺管(腸上皮化生腺管)と腸上皮化生を示さない幽門部腺管(非腸上皮化生腺管)10組について、SOX2遺伝子発現を検討した。腸上皮化生腺管では、非腸上皮化生腺管に比べ、明らかにSOX2遺伝子の発現が低下していた。今後、この発現低下が、胃形質の消失につながるか否かを明らかにするため、SOX2を発現し、かつ、胃形質を保持する細胞でのノックダウンの実験、または、マウスでのコンディショナルなノックアウトの実験が必要である。
更に、SOX2遺伝子の発現低下におけるDNAメチル化の関与を検討するため、SOX2のエクソン1のCpGアイランドのメチル化状態を解析した。一つの腸上皮化生腺管の中にも、胃型の形質をもつ細胞も残存するため、定量的methylation-specific PCRにより、メチル化されたDNA分子の割合を定量した。その結果、腸上皮化生の発生に伴い、SOX2遺伝子のメチル化が出現することが確認された。さらに、その後明らかになったプロモーター領域と思われるCpGアイランドについてもメチル化解析を行ったが、こちらにはメチル化は認めなかった。
【多クローナルな疾患でのメチル化異常】 本研究により、腸上皮化生の様な多クローナルな疾患でも、CpGアイランドのメチル化の変化が存在することが明らかになった。SIM2のイントロン2領域のCpGアイランド、CpGアイランド#15, #19、SOX2のエクソン1のCpGアイランドなどが相当する。従って、複数の幹細胞において、同一のCpGアイランドのメチル化状態が変化していると考えられた。しかし、これらのCpGアイランドは遺伝子プロモーター領域には由来せず、遺伝子発現をサイレンシングの原因となるメチル化変化とは考えにくかった。
結論
MS-RDA法により、多クローナルな分化異常である腸上皮化生で、複数の腺管に同一のメチル化異常が生じていることを示した。現在のところ、遺伝子発現変化の原因となるものは見出されていないが、改良したMS-RDA法により、今後見出される可能性が高いと考えている。一方、既知遺伝子として解析したホメオボックス遺伝子SOX2については、腸上皮化生の発生と相関した発現低下、及び、エクソン1のCpGアイランドのメチル化を認めた。SOX2遺伝子にマスター遺伝子としての機能があるか否か、今後、検討を進める。
公開日・更新日
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