文献情報
文献番号
200200251A
報告書区分
総括
研究課題名
染色体不安定症候群の細胞老化機構
課題番号
-
研究年度
平成14(2002)年度
研究代表者(所属機関)
小松 賢志(広島大学原爆放射能医学研究所)
研究分担者(所属機関)
- 松浦伸也(広島大学原爆放射線医科学研究所)
- 田原栄俊(広島大学医歯薬総合研究科)
研究区分
厚生労働科学研究費補助金 総合的プロジェクト研究分野 長寿科学総合研究
研究開始年度
平成12(2000)年度
研究終了予定年度
平成14(2002)年度
研究費
6,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
老化に伴い細胞の染色体異常や突然変異の増加などゲノム不安定性が誘発される事は以前から知られていたが、最近、モデル動物の線虫の研究からゲノム不安定性が逆に老化を促進する事が明らかになってきた。実際、ゲノム不安定性を呈するヒト遺伝病ではがんや免疫不全と共に早期老化を示す。この事は早期老化を穏やかに進行する疾病としてがんなどと同列に議論できる事を意味している。本研究ではゲノム不安定性による老化機構を明らかにして、遺伝的および環境因子・生活習慣による早期老化の診断と予防に役立てる事を目的とする。
研究方法
(イ)NBS1蛋白によるテロメア延長機構:NBS樹立細胞がNBS1cDNA導入後にテロメアが延長することを確認した後に、その延長機構を明らかにする。すなわち、テロメア複製期のNBS1とTRF2の相互作用や免疫染色による共局在そしてG-tailやテロメア長を指標としたdeletion mutant実験によりテロメア蛋白の作用機序を解析する。(ロ)NBS1の老化シグナル伝達経路:NBS1はATMによって直接リン酸化を受けるが、リン酸化部位
に突然変異がおきてもNBS1蛋白の機能に異常が見られないことから、NBS1/ATMのシグナル経路は間接的である可能性が示唆される。DNA修復の開始にあたってリモデリングなどヒストンの何らかの修飾がなされる必要がある事からヒストンを介しての機能が重要である。ヒストンH2AXのC末には、真核生物を通じて良く保存されているSQ(セリン/グルタミン)モチーフが存在するのでセリンのリン酸化抗体を作製して、放射線照射によるリン酸化と蛋白間相互作用をIP-ウエスタン法で検討する。(ハ)ノックアウトマウスとチキンNBS細胞の作製:チキンB細胞由来のDT40細胞は遺伝子ノックアウトの効率が通常の高等真核細胞の数百倍高頻度であるのでノックアウト細胞の作製に良く使用される。我々は初めにNBS1のN末側保存領域FHA/BRCTドメインに設計した変成プライマーを用いて、RT-PCRによりチキン胚由来のcDNAライブラリーをスクリーニングして得られたチキンNbs1のエクソン2からエクソン6に相当する約5.5kbのゲノムDNAを用いてDT40細胞のNbs1遺伝子をターゲッティングする。続いて、マウスNbs1遺伝子をD3-ES細胞からスクリーニングする。ベクターPGK-neo-polyA とHSV-tkによりFA蛋白C末側の変異導入による相同組み換え体を確認して、C57BL/6の3.5日胚から回収したブラシスト内注入によりキメラマウスを作製する。(ニ)相同組換えによるテロメア延長:我々は最近、SCneoレポーター遺伝子を用いる相同組換えアッセイ系を確立したので、テロメア複製にも関係するとされる相同組換え能をチキンNBS細胞を用いて定量的に測定する。一方、DNA二重鎖切断のもう一つの修復経路である非相同末端再結合をpDVH14レポーター遺伝子を用いてチキンNBS細胞の非相同末端再結合能が正常かどうかを検討する。(ホ)ファンコニー貧血細胞の老化シグナル;NBSやATと同様に染色体不安定性症候群に分類され、テロメア短縮促進が示唆されているファンコニー貧血の原因遺伝子の機能をIPウエスタン法による蛋白間相互作用や放射線照射によるリン酸化ならびにユビキチン化によるシグナル伝達をNBS1/ATM経路と比較する。
に突然変異がおきてもNBS1蛋白の機能に異常が見られないことから、NBS1/ATMのシグナル経路は間接的である可能性が示唆される。DNA修復の開始にあたってリモデリングなどヒストンの何らかの修飾がなされる必要がある事からヒストンを介しての機能が重要である。ヒストンH2AXのC末には、真核生物を通じて良く保存されているSQ(セリン/グルタミン)モチーフが存在するのでセリンのリン酸化抗体を作製して、放射線照射によるリン酸化と蛋白間相互作用をIP-ウエスタン法で検討する。(ハ)ノックアウトマウスとチキンNBS細胞の作製:チキンB細胞由来のDT40細胞は遺伝子ノックアウトの効率が通常の高等真核細胞の数百倍高頻度であるのでノックアウト細胞の作製に良く使用される。我々は初めにNBS1のN末側保存領域FHA/BRCTドメインに設計した変成プライマーを用いて、RT-PCRによりチキン胚由来のcDNAライブラリーをスクリーニングして得られたチキンNbs1のエクソン2からエクソン6に相当する約5.5kbのゲノムDNAを用いてDT40細胞のNbs1遺伝子をターゲッティングする。続いて、マウスNbs1遺伝子をD3-ES細胞からスクリーニングする。ベクターPGK-neo-polyA とHSV-tkによりFA蛋白C末側の変異導入による相同組み換え体を確認して、C57BL/6の3.5日胚から回収したブラシスト内注入によりキメラマウスを作製する。(ニ)相同組換えによるテロメア延長:我々は最近、SCneoレポーター遺伝子を用いる相同組換えアッセイ系を確立したので、テロメア複製にも関係するとされる相同組換え能をチキンNBS細胞を用いて定量的に測定する。一方、DNA二重鎖切断のもう一つの修復経路である非相同末端再結合をpDVH14レポーター遺伝子を用いてチキンNBS細胞の非相同末端再結合能が正常かどうかを検討する。(ホ)ファンコニー貧血細胞の老化シグナル;NBSやATと同様に染色体不安定性症候群に分類され、テロメア短縮促進が示唆されているファンコニー貧血の原因遺伝子の機能をIPウエスタン法による蛋白間相互作用や放射線照射によるリン酸化ならびにユビキチン化によるシグナル伝達をNBS1/ATM経路と比較する。
結果と考察
初めに、マウスNbs1遺伝子のエキソン4以降をターゲッテングしたマウスを二種類作製した。一種類のノックアウトマウスでは胎生8.5日で致死になるが細胞株が樹立可能であった。これに対して、Cre-Loxにより選択マーカーのneo遺伝子を除いたノックアウトマウスでは胎生3.5日で致死になり、細胞株化も不可能であった。正確な原因は現在解析中であるが、NBS1のC末側蛋白の発現が関係していると思われる。一方、正常細胞が極一部存在するキメラマウスが偶発的に発生した。このマウスは免疫グロブリンの低下や性腺低形成などヒトNBS患者の臨床症状を呈すると共に、放射線照射後に体毛が早期に白色化して正常マウスに比較して老化傾向を示した。また、このマウスから樹立したNBSマウス細胞はヒトマウス細胞と同程度の放射線感受性を示した。
続いて、ヒストンH2AXのリン酸化(γ-H2AX)を介するNBS1の損傷シグナル伝達について解析した。この結果、γ-H2AXは免疫染色によるフォーカスとして観測されるが、γ-H2AXフォーカスはまたNBS1フォーカスとも共局在していた。さらに、リン酸化H2AXの抗体による免疫沈降物(IP)にはNBS1蛋白が存在しており、NBS1は放射線照射後にγ-H2AXと結合することが示された。また、このIP複合体にはhMre11も存在するが、NBS1が欠失したNBS細胞のIP複合体ではhMre11が見られないことから、hMre11はNBS1を介してγ-H2AXに結合していると思われた。この事は、hMre11結合領域を欠失したNBS1変異蛋白でもNBS1がH2AXに結合して、照射によるフォーカスも形成することからも確認できた。興味深い事にこの実験では、NBS1のN末側を欠失した変異細胞ではNBS1のフォーカス形成もH2AXへの結合も見られなかった。さらに、C末側のNBS1リコンビナント蛋白ではこの結合は見られなかったが、N末側のFHA/BRCT領域のリコンビナント蛋白ではγ-H2AXとの結合が確認されたことから、NBS1蛋白は補助因子を介さずに直接FHA/BRCTドメインでH2AXと結合していることを示された。
一方、NBS1の酵母ホモログXrs2はDNA二重鎖切断の非相同DNA末端再結合と相同組換え修復の両方に係わる蛋白であるとされてきた。チキンNbs1細胞では細胞細胞当たり1～2に減少していた。姉妹染色体分体交換の機構は不明であるが相同組換えが関与していると言われている。また、IgAやOVAなどへのターゲテング効率がチキンNbs1細胞で極端に低下していることからも相同組換え能の低下が示唆された。そこで、SCneoレポーター遺伝子を用いて相同組換え能の直接測定を試みた。この系では、I-Sce1プラスミドの
細胞内への導入により発生したDNA二重鎖切断切断が再結合が出来ない細胞は致死になり、また非相同末端再結合機構により結合した細胞もG418選択薬剤で致死になる。これに対して相同組換えで修復した細胞ではneo遺伝子が発現して生存可能となるのでそのコロニー数のカウントで相同組換え能が測定できる。この結果、正常細胞に比較してチキンNBS細胞の相同組換え能は100分の1以下に低下していることが判明した。一方、DNA二重鎖切断のもう一つの修復経路である非相同末端再結合をpDVH14レポーター遺伝子を用いて測定した結果、チキンNBS細胞の非相同末端再結合能は正常細胞と同程度であることが明らかとなった。
NBS1がテロメア維持に関わっていることはNBS患者の皮膚線維芽細胞の細胞分裂によるテロメア長をサザン法により測定した結果、テロメア短縮が促進される事から明らかとなった。そこで、二重免疫染色法によりテロメア於けるNBS1フォーカス形成を観察した結果、フォーカスは細胞周期のS期において見られた。また、この時期に一致してテロメア蛋白TRF2とNBS1が結合していることがIP-ウエスタン法により確認できた。DNA修復ではNBS1蛋白の損傷部位へのリクルートにATMが関与しているので、ATMが欠損している毛細血管拡張性運動失調症細胞を用いてS期でのテロメアへのNBS1蛋白のリクルートを検討した。しかしながら、毛細血管拡張性運動失調症細胞でも正常細胞と同様にNBS1はTRF2と結合が出来、またフォーカスが形成されることが判明した。この事からNBS1蛋白のリクルート機構はDNA修復とテロメア維持では異なることが確認された。
染色体不安定症候群のファンコニー貧血の相補性群についても解析した結果、放射線感受性を示すD1群とその他の感受性を示さないファンコニー細胞の2種類に分類されることが示された。しかしながら、放射線感受性を示さない細胞に分類されるD2群の遺伝子FANCD2は放射線損傷部位にフォーカスを形成する事が示された。このフォーカス形成にはFANC蛋白複合体とBRCA1が必要であり、さらにNBS1蛋白の存在がこのフォーカス形成を促進する事が確認された。この事から、ファンコニー蛋白はNBS1蛋白を介してテロメア維持に関わっていることが示された。
続いて、ヒストンH2AXのリン酸化(γ-H2AX)を介するNBS1の損傷シグナル伝達について解析した。この結果、γ-H2AXは免疫染色によるフォーカスとして観測されるが、γ-H2AXフォーカスはまたNBS1フォーカスとも共局在していた。さらに、リン酸化H2AXの抗体による免疫沈降物(IP)にはNBS1蛋白が存在しており、NBS1は放射線照射後にγ-H2AXと結合することが示された。また、このIP複合体にはhMre11も存在するが、NBS1が欠失したNBS細胞のIP複合体ではhMre11が見られないことから、hMre11はNBS1を介してγ-H2AXに結合していると思われた。この事は、hMre11結合領域を欠失したNBS1変異蛋白でもNBS1がH2AXに結合して、照射によるフォーカスも形成することからも確認できた。興味深い事にこの実験では、NBS1のN末側を欠失した変異細胞ではNBS1のフォーカス形成もH2AXへの結合も見られなかった。さらに、C末側のNBS1リコンビナント蛋白ではこの結合は見られなかったが、N末側のFHA/BRCT領域のリコンビナント蛋白ではγ-H2AXとの結合が確認されたことから、NBS1蛋白は補助因子を介さずに直接FHA/BRCTドメインでH2AXと結合していることを示された。
一方、NBS1の酵母ホモログXrs2はDNA二重鎖切断の非相同DNA末端再結合と相同組換え修復の両方に係わる蛋白であるとされてきた。チキンNbs1細胞では細胞細胞当たり1～2に減少していた。姉妹染色体分体交換の機構は不明であるが相同組換えが関与していると言われている。また、IgAやOVAなどへのターゲテング効率がチキンNbs1細胞で極端に低下していることからも相同組換え能の低下が示唆された。そこで、SCneoレポーター遺伝子を用いて相同組換え能の直接測定を試みた。この系では、I-Sce1プラスミドの
細胞内への導入により発生したDNA二重鎖切断切断が再結合が出来ない細胞は致死になり、また非相同末端再結合機構により結合した細胞もG418選択薬剤で致死になる。これに対して相同組換えで修復した細胞ではneo遺伝子が発現して生存可能となるのでそのコロニー数のカウントで相同組換え能が測定できる。この結果、正常細胞に比較してチキンNBS細胞の相同組換え能は100分の1以下に低下していることが判明した。一方、DNA二重鎖切断のもう一つの修復経路である非相同末端再結合をpDVH14レポーター遺伝子を用いて測定した結果、チキンNBS細胞の非相同末端再結合能は正常細胞と同程度であることが明らかとなった。
NBS1がテロメア維持に関わっていることはNBS患者の皮膚線維芽細胞の細胞分裂によるテロメア長をサザン法により測定した結果、テロメア短縮が促進される事から明らかとなった。そこで、二重免疫染色法によりテロメア於けるNBS1フォーカス形成を観察した結果、フォーカスは細胞周期のS期において見られた。また、この時期に一致してテロメア蛋白TRF2とNBS1が結合していることがIP-ウエスタン法により確認できた。DNA修復ではNBS1蛋白の損傷部位へのリクルートにATMが関与しているので、ATMが欠損している毛細血管拡張性運動失調症細胞を用いてS期でのテロメアへのNBS1蛋白のリクルートを検討した。しかしながら、毛細血管拡張性運動失調症細胞でも正常細胞と同様にNBS1はTRF2と結合が出来、またフォーカスが形成されることが判明した。この事からNBS1蛋白のリクルート機構はDNA修復とテロメア維持では異なることが確認された。
染色体不安定症候群のファンコニー貧血の相補性群についても解析した結果、放射線感受性を示すD1群とその他の感受性を示さないファンコニー細胞の2種類に分類されることが示された。しかしながら、放射線感受性を示さない細胞に分類されるD2群の遺伝子FANCD2は放射線損傷部位にフォーカスを形成する事が示された。このフォーカス形成にはFANC蛋白複合体とBRCA1が必要であり、さらにNBS1蛋白の存在がこのフォーカス形成を促進する事が確認された。この事から、ファンコニー蛋白はNBS1蛋白を介してテロメア維持に関わっていることが示された。
結論
染色体不安定性症候群のヒト遺伝病ナイミーヘン症候群の原因遺伝子NBS1が染色体末端テロメアの維持と細胞老化、そしてマウス個体レベルの老化に関わっていることが示された。NBS1はDNA修復とシグナル伝達の両機能を有しており、その破綻は相同組換えと細胞周期チェックポイントの異常を呈することが確認された。NBS1は細胞周期依存性にテロメア蛋白TRF2に結合する事から、DNA損傷応答と同様の機能がテロメア維持にも重要であることが確認された。
公開日・更新日
公開日
-
更新日
-