内分泌かく乱化学物質の作用機構に焦点を当てた新しいハイ・スルー・プットスクリーニング法の開発(総括研究報告書)

文献情報

• 文献番号: 200100930A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: 内分泌かく乱化学物質の作用機構に焦点を当てた新しいハイ・スルー・プットスクリーニング法の開発(総括研究報告書)
• 研究課題名（英字）: -
• 課題番号: -
• 研究年度: 平成13(2001)年度
• 研究代表者(所属機関): 菅野 純(国立医薬品食品衛生研究所)

研究分担者(所属機関)

• 井上 達(国立医薬品食品衛生研究所)
• 小野 敦(国立医薬品食品衛生研究所)
• 板井　昭子(医薬分子設計研究所)

• 研究区分: 厚生科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 生活安全総合研究事業
• 研究開始年度: 平成11(1999)年度
• 研究終了予定年度: 平成13(2001)年度
• 研究費: 70,000,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

化学物質が生物の内分泌系を撹乱し、野生生物及びヒトの健康に影響を及ぼすことが懸念されている。その一方、我々の現代生活においては膨大な種類の化学物質が利用されており、これらの化学物質が内分泌かく乱作用を有するかどうかを早急に調査する必要がある。このため、わが国では米国が提案している化学物質の内分泌かく乱作用の有無を評価する方法の有用性を独自の立場から検討するとともに、必要な改良を行うための研究を平成10年度に立ち上げ、当研究課題において引き続き測定を継続している。内分泌かく乱化学物質問題には、1) ヒトが暴露されうる既存化学物質及び、今後暴露されうる新規化学物質のホルモン作用活性の緊急的検出作業にあわせて、2) 無作用量と無毒性量の見極めや、胎児影響の解析など、化学物質による内分泌かく乱の分子生物学的メカニズム解明が必要な研究対象とがあり、既存概念に基づく手法のみならず、メカニズム研究によりもたらされる新しい手法の検討が必須である。これらの情勢をふまえ、本研究では(1)ハイ・スルー・プットスクリーニング(High Through Put Screening、HTPS)を利用した超高速分析法の検証に関する調査研究として、これまでに引き続き、ルシフェラーゼ遺伝子をER反応レポーターとして、human ER alpha常時発現Plasmidとともに組込んだヒト由来の細胞(HeLa cell)を使用し、化学物質のホルモン受容体作用活性の高速スクリーニング試験法の開発及びその検証を行った。また、ホルモン受容体の遺伝子制御メカニズムを応用した、(2)表面プラズモン共鳴による新規無細胞系高速分析(表面プラズモン共鳴 High Through Put Screening、SPR-HTPS) の開発について検討した。SPR-HTPS法は、各種ホルモン受容体分子に対する化学物質の相互作用を高精度に測定可能な新規かつ信頼性の高い方法である。これまでにこの系で得られるリアルタイム情報から、受容体におけるagonist効果(作動)/antagonist効果(阻害)などの分子メカニズムに関連を示唆する結果を得ており、本年度はさらに多くの化学物質を用いて、その有用性についての検証を進め、生体作用との関連について解析を進めた。さらに今年度は、内分泌かく乱化学物質の標的受容体への相互作用を原子レベルで理論的計算解析するin silicoにおけるドッキングスタディにより超高速スクリーニングする(3)内分泌かく乱化学物質の計算探索と評価についての検討を行った。

研究方法

(1)については、引き続きレポーター遺伝子導入ヒト由来培養細胞系を用いた高速自動分析法実証と有効性の検証を目的としてこれまでに引き続き直鎖アルキルフェノール類をはじめとした化合物についてER agonist及びantagonist活性の測定を実施し、得られた結果に関して、他のスクリーニング系との比較検討を行った。さらに、国際的動向を把握するため、OECDにおけるハザードアセスメント新規試験法のバリデーションに関する会議に出席し、我が国のHTPSの国際的位置関係や将来性の評価と現時点での問題点の整理を行った。(2)については、これまでに構築したERとER応答DNA配列(ERE)との相互作用を測定する系にあわせ、共役因子TIF2の受容体結合部位を相互作用プローブとして用いる系(TIFアッセイ)を構築しHTPS向けに至適化した。これら2つの系を用いて、昨年度EREアッセイを行った30種類の化学物質についてTIFアッセイを、36種類の新規化学物質についてERE、TIFの両アッセイを行い、一次スクリーニング法としての有用性について検討した。(3)に
ついては、X線結晶構造が明らかにされているアンタゴニスト結合型ERαリガンド結合ドメインに対して、数十万種の市販化学物質が登録されているデータベースのバーチャルスクリーニングを実施した。自動ドッキングプログラムにより各化学物質の結合様式を推定しその結合親和性を比較することにより、アンタゴニスト結合型エストロゲンα受容体に安定に結合すると推定される化学物質を選び出した。

結果と考察

(1)　HTPSを利用した超高速分析法の検証に関する調査研究は、(1)-1.　レポーター遺伝子導入ヒト由来培養細胞株を用いた超高速分析法に関する試験研究　(主任研究者:(財)化学物質評価研究機構に対する委託業務)及び(1)-2.　超高速選別法の検証の評価に関する調査研究　(分担研究者　井上　達　国立医薬品食品衛生研究所)よりなり、前者委託研究ではER agonist及びantagonist活性の測定を42物質について、また直鎖アルキルフェノール類149物質についてER antagonist活性の測定行った結果、比較的強いER alphaアゴニスト活性が26物質で、アンタゴニスト活性が8物質に検出された。後者研究では、内分泌かく乱物質を含む化学物質のハザードアセスメントにおいて、OECDにおいては従来の毒性手法に合わせ、現時点での問題点を考慮した、科学の進歩に即応した新規試験法開発の重要性が確認された。(2) High Through Put Screening、SPR-HTPSの開発研究は、(2)-1.　「表面プラズモン共鳴高速分析によるデータの高速取得技術及びHTPS に特化するための試験」　(主任研究者:ビアコア株式会社に対する委託業務)(2)-2.　内分泌かく乱化学物質の作用機構を考慮した表面プラズモン共鳴法による検出系の開発(分担研究者:小野　敦　国立医薬品食品衛生研究所・毒性部)よりなる。前者委託研究においては、これまでに引き続き各種化学物質のER-ERE相互作用の変化量が、他のスクリーニング系における結果と相関すること、およびコファクター配列との相互作用は結合した化合物により大きく異なることが明らかになった。後者においては、ヒトプロモーターにおける特殊なERE配列について、ERとの相互作用変化を検討するため測定条件の至適化と、新規プローブ固定化法の検討を行い、一部のEREでは化合物によるER構造の差がより明らかに示された。また、fosEREなどの対向配列でないER結合配列において、ERがモノマーで結合することが示された。　(3)内分泌かく乱物質の電算探索と評価(分担研究者:板井　昭子(株)医薬分子設計研究所)では、ラロキシフェン結合ER結晶構造を標的としたアンタゴニスト選別計算法を用いた市販化合物データベースのバーチャルスクリーニングにより、既知のアンタゴニストとは構造が大きく異なる化合物が選別され、内分泌かく乱物質の初期スクリーニングに有用であることが示された。

結論

化学物質による内分泌かく乱問題ではかく乱性の有無を確認するための優先順位付けを早急に行うことが求められている。本研究におけるレポーター遺伝子導入ヒト由来培養細胞株を用いた超高速分析法では、新たに比較的強いER alphaアゴニスト活性が26物質で、アンタゴニスト活性が8物質に検出された。これらの物質についてはin vivo実験での成績、選出基準等について更に検討する必要はあるが、本法の簡便さ、短期間で多量の化学物質について測定を行うことが可能な点などから、有用な内分泌かく乱化学物質試験法の候補になるものと思われる。また現在、ヒト由来培養細胞レポーターアッセイ系で実用に耐え得るレベルにあるものとしては、我が国のERαに関するシステムが世界をリードしており、この系から発信されるデータについては、その有用性を含めて、今後の研究開発の方向性を見極める作業が必要である。一方、内分泌かく乱物質の作用メカニズムに焦点をあてたスクリーニング法の開発のためにホルモンレセプターを用いたアッセイ方法の開発研究については、EREおよびTIFとの相互作用変化を指標としたアッセイ法の有用性の検討の結果、これらを組み合わせることで簡便にアゴニストとアンタゴニストの検出、およびTIFアッセイにおいては、幾つかのアゴニストが特徴
的な相互作用を示し、この受容体作用の違いから生体作用の違いについても検討出来る可能性が示唆された。今後、各種ERE配列および共役因子との相互作用を検討するための測定より、生体作用に関連するより多くの有用な情報が得られものと考察された。さらに、内分泌かく乱物質の電算探索によるin silicoスクリーニングでは、既知リガンドと構造が全く異なる候補化合物であっても非常に高速に高精度の結果を得られることから、内分泌かく乱化学物質の初期スクリーニングに有用である。これらを組み合わせることで、次の段階として詳細試験に供する化学物質の科学的根拠に基づくより正確な優先化合物の抽出が期待される。OECDにおいても科学的進歩に即応した新規試験法開発の重要性が確認されたことから、今後は本研究班でこれまでに進めてきた内分泌かく乱化学物質の試験法を始め個別の試験法についてより具体的な国際的合意に向けた動きが活発化するものと考察された。

公開日・更新日

• 公開日: -
• 更新日: -