文献情報
文献番号
200100915A
報告書区分
総括
研究課題名
食品中の微生物のリスク評価に関する研究
研究課題名（英字）
-
課題番号
-
研究年度
平成13(2001)年度
研究代表者(所属機関)
山本 茂貴(国立感染症研究所)
研究分担者(所属機関)
- 春日文子(国立感染症研究所)
- 岡部信彦(国立感染症研究所)
- 熊谷進(東京大学)
- 武田直和(国立感染症研究所)
- 品川森一(帯広畜産大学)
研究区分
厚生科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 生活安全総合研究事業
研究開始年度
平成13(2001)年度
研究終了予定年度
平成15(2003)年度
研究費
37,500,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
近年、食中毒のみならず牛海綿状脳症(狂牛病)など食品に関連した国際的問題が顕在化しており、その現状把握並びに防除対策の確立が早急に必要な状況となっている。つまり、食品の微生物危害を防除するための規格基準は微生物学的リスクアナリシスをツールとして策定する必要がある。一方、FAO/WHOはCODEX委員会食品衛生部会での議論を受け、国際的リスクアセスメントを開始したが、各国でもこれらを検証していく必要がある。そこで、本研究では、国際的リスクアセスメント手法の有効性を検証しつつ日本における微生物学的リスクアセスメントの手法を開発することを目的とする。さらに、主要な食中毒菌に対する日本独自のリスクアセスメントを行い、同時に、SRSVや牛海綿状脳症の実態調査並びにリスクアセスメントに必要な基礎データの収集を行いリスクアセスメントの精度の向上を図ることも目的とする。
研究方法
研究方法および
1.家庭での卵の生食に伴うSalmonella Enteritidis感染のリスクアセスメントモデル
家庭での卵の生食に伴うSalmonella Enteritidis感染を対象に、リスクアセスメントモデルを構築した。できる限り日本のデータを用いたほか、モデリングの基本的骨格はUSDAとFAO/WHOによるモデルを参照した。
Exposure Assessmentは、卵の生産、流通、消費の3段階のみを考慮した。@RISK (Palisade Corp.)を用いて試行回数3万回のMonte Carloシミュレーション行ない、確率分布を伴う結果を求めた。1年間に日本全国の家庭において、生卵の摂食に伴うSalmonella Enteritidis感染の総患者数は、平均値として28,274人と推定された。
Hazard Characterizationでは、日本で得られた食中毒データを中心にFAO/WHOのリスクアセスメントにおいて算出された、摂食菌数-発症率の相関式をあてはめた。
Risk Characterizationでは、流通段階における可能な対策案として、室温流通下での販売期限を14日あるいは7日に設定する方法、ならびに期限を特に設定せず農場出荷後の温度を7℃以下に保持する方法を取り上げ、それらの効果を比較した。今回仮定した条件下では、いずれの方法も、結果としての患者発生数にほとんど影響を及ぼさなかった。 感度分析を行なったところ、結果に大きな影響を持つ因子は、産卵直後の卵中のSalmonella Enteritidis菌数と、農場での鶏群汚染率ならびに鶏群内感染率であると分析された。
2.Exposure Assessmentのための基礎知見としての予測微生物学的研究
(1)E.coli O157:H7の熱抵抗性ならびに酸抵抗性
平成8年日本の集団食中毒事例から分離されたE.coli O157:H7菌株ならびにアメリカで分離されたATCC株を用い、それらの熱抵抗性と酸抵抗性を比較するとともに、熱抵抗曲線や酸抵抗曲線の近似式を求めた。日本でほぼ同時期に分離された菌株は、熱抵抗性の上で大きく2つに分類された。また、50℃10分間加熱した菌株は、塩酸に対して抵抗性を有するようになった。
(2)Vibrio parahaemolyticusの熱抵抗性ならびに凍結に伴う菌の生残動態
近年日本で分離されたVibrio parahaemolyticus菌株を用い、熱抵抗曲線の近似式を求めた。さらに、凍結に弱いとされているV. parahaemolyticusが、検食システムにより食品中で凍結保存された場合、どのような生菌数の変化が起こるのかを推定するために、食品に接種した菌数の凍結後の変化を測定した。ホタテとアオヤギに接種したV. parahaemolyticusは0時から1日後まで、急激に10～104個低下し、その後緩慢に減少していった。
3.Exposure Assessmentのための基礎知見としての、調理過程における二次汚染のモデル化に関する研究
(1)手指を介した一般生菌ならびに大腸菌群の移行動態
二次汚染を、手指を介する場合と調理器具表面を介する場合とに分け、定量実験を行った。手指を介する場合として、さらに、調理実習中の原材料から手指への一般生菌ならびに大腸菌群の移行と、手指に塗布された既知量の大腸菌の生食用食材への移行の2ステップについて、それぞれデータを採取した。
調理実習において、初期菌数の高い鶏挽肉ともやしをそれぞれ下処理した際、食材ごとに一定した割合で、一般生菌も大腸菌群も手指へ移行することがわかった。菌数測定に関する検出効率も勘案しつつ、これら移行率ならびに手指から生食用食材への移行率について、確率分布を考慮したモデリングを行った。
(2)調理器具表面を介したSalmonella Enteritidisの移行動態
(1)と同様に、調理器具表面を介する二次汚染のモデリングのための実験を行った。Salmonella Enteritidisによって汚染された卵液が調理台上にこぼれ、それを拭き取ったふきんによって食卓表面に塗布され、食卓上に落下した食品を介して最終的に摂食される、というシナリオを想定した。各段階でSalmonella Enteritidisの菌数を測定して確率論的モデリングを行った。
4.腸炎ビブリオの東南アジアでの流行実態、及び日本での汚染実態調査。
(1)世界的大流行を起こしている腸炎ビブリオの新型クローンによる感染症発生状況、魚介類の汚染状況、および両者の相関関係を明らかにするための研究を実施した。本クローンによる感染症が多発するタイ南部ソンクラ地区の2つの市中病院で下痢患者糞便を検査したところ、1年間で317検体から腸炎ビブリオを分離できた。そのうち242検体(76%)に由来する菌株が新型クローンに属しており、この地域では新型クローンによる感染症が多発していることが明らかになった。新型クローンの血清型はO3:K6型(80%)、O4:K68型(8.4%)O1:K25型(6.9%)、O1:KUT型(1.8%)、O1:K41型(0.32%)、O4:K12型(0.32%)であり、従来報告されていた血清型分布より多様であることが明らかになった。一方同地域で市販されている新鮮魚介類中の新型腸炎ビブリオの分布を検査した。検査は免疫磁気ビーズ法を取り入れた方法で、1998年から2000年度までの検査では、魚介類のうち貝類からのみ目的の新型クローンが分離できた(検査総数284検体のうち貝類136検体、陽性貝類4検体)ので、2001年度は、貝類を中心に検査した(検査総数132検体のうち貝類136検体)。その結果7検体が陽性であった。したがって、タイ南部ソンクラ地区の海洋環境中には高頻度で新クローンが分布していると考えられる。また2001年度に分離した新型クローン菌株の血清型は、O3:K6型5株、O3:KUT型1株、およびO1:K25型1株であった。これらの血清型分布は患者分離新型クローン菌株の血清型分布と強い相関関係を示しており、現地で漁獲・販売されている貝類が感染症の原因食品であることを示唆していると言える。
(2)市販の岩がき78検体中7検体から、採取された後冷蔵温度下で運搬されたアオヤギ29袋のうち7袋から、流通市場で販売されていたアオヤギ31検体中4検体から、それぞれtdh遺伝子が検出された。冷蔵保管と30℃保管との比較実験等の成績から、低温管理されない場合には、毒素産生株が検出されやすくなることが示された。腸炎ビブリオとtdh陽性腸炎ビブリオの両者の菌数比較の結果、14検体のうち4検体については、腸炎ビブリオ総菌数がtdh陽性腸炎ビブリオ菌数の1000倍以上、9検体については100倍以上、すべての検体について10倍以上であることが認められた。
(3)腸炎ビブリオO3K6とその他の株について、海水、人工海水、10倍希釈人工海水における生残菌数を20℃および5℃下で逐次的に計測した。その結果いずれの株も、低温下における方が死滅しやすいこと、いずれの温度においてもO3K6とその他の株間で顕著な差異は認められなかったことから、近年O3:K6株が優勢となったことは、海水中での生残における他株との相違によるものではないものと考えられた。
5.SRSVの検出法の開発、発生動向および検出動向調査。
(1)ノーウォーク様ウイルス(NLV)に特異的な抗体を結合した磁気ビーズを調製し、推定原因食品からNLVを回収した後にRT-PCRを実施し、NLVを検出することを試みた。食中毒患者の糞便検体を用いたRT-PCRと抗原検出ELISAの検査成績から、Chiba型NLVの関与が推定された食中毒事件において、本法でNLVの検出をおこなったところ、残品食品9品目のうちの2品目からNLV遺伝子を検出することができた。また、遺伝子解析の結果、食中毒患者糞便と食品に由来するNLVは互いに極めて近縁なNLVであることが確認された。磁気ビーズを利用した免疫捕獲 RT-PCR法は、多数の検体の迅速処理が可能であり、かつ簡便なNLVの検出法として食中毒検査には有用な方法であると考えられた。
(2)ノーウォークウイルスのリスク評価の基礎データを得る目的で、カキによる食中毒発生原因食品カキ、市販生カキのNV汚染状況、カキ養殖海域の海水とカキのNV汚染状況、リアルタイムPCR法の検討を行なった。原因カキでは半分の事例からカキ1個当たりNV200コピー以上の汚染が認められた。市販生カキでは15%に200コピー/個以上の汚染が明らかとなり、1月、2月にNV汚染されているカキの比率が高く、且つNV量も多いことが明らかとなった。海水とカキの汚染では明らかな関連性は見出せなかったが、今後調査方法の検討が必要である。リアルタイムPCR法は低い価での再現性に問題があり、今後、検出感度を高めると共に、診断基準の作成が必要である。
6.BSEの調査
屠畜場に搬入された反すう動物の内、神経症状が疑われた牛及び1.5歳以上の羊の中枢神経組織からプリオン検出を実施した。新鮮組織の場合はウエスタンブロット、固定組織の場合は免疫染色を行った。
10月18日からは屠畜場に搬入された牛は全頭検査を行うこととなったため、牛検体はまず都道府県でELISA法による一次検査がおこなわれ、陽性となったものが確定検査のために送付されてくる。
羊は現在までに23検体、牛は全頭検査実施までに検査した204検体すべてが陰性であった。この間、5月に屠畜場外で発生したスクレイピー1例を摘発した。
牛は11月末までに126,911頭が検査され、北海道及び埼玉で各1例、合計2例の陽性牛が摘発された。
一方、確定診断の診断のための検査法の時間短縮と感度向上を目的とした改良を加え検査法のプロとコールを完成した。
1.家庭での卵の生食に伴うSalmonella Enteritidis感染のリスクアセスメントモデル
家庭での卵の生食に伴うSalmonella Enteritidis感染を対象に、リスクアセスメントモデルを構築した。できる限り日本のデータを用いたほか、モデリングの基本的骨格はUSDAとFAO/WHOによるモデルを参照した。
Exposure Assessmentは、卵の生産、流通、消費の3段階のみを考慮した。@RISK (Palisade Corp.)を用いて試行回数3万回のMonte Carloシミュレーション行ない、確率分布を伴う結果を求めた。1年間に日本全国の家庭において、生卵の摂食に伴うSalmonella Enteritidis感染の総患者数は、平均値として28,274人と推定された。
Hazard Characterizationでは、日本で得られた食中毒データを中心にFAO/WHOのリスクアセスメントにおいて算出された、摂食菌数-発症率の相関式をあてはめた。
Risk Characterizationでは、流通段階における可能な対策案として、室温流通下での販売期限を14日あるいは7日に設定する方法、ならびに期限を特に設定せず農場出荷後の温度を7℃以下に保持する方法を取り上げ、それらの効果を比較した。今回仮定した条件下では、いずれの方法も、結果としての患者発生数にほとんど影響を及ぼさなかった。 感度分析を行なったところ、結果に大きな影響を持つ因子は、産卵直後の卵中のSalmonella Enteritidis菌数と、農場での鶏群汚染率ならびに鶏群内感染率であると分析された。
2.Exposure Assessmentのための基礎知見としての予測微生物学的研究
(1)E.coli O157:H7の熱抵抗性ならびに酸抵抗性
平成8年日本の集団食中毒事例から分離されたE.coli O157:H7菌株ならびにアメリカで分離されたATCC株を用い、それらの熱抵抗性と酸抵抗性を比較するとともに、熱抵抗曲線や酸抵抗曲線の近似式を求めた。日本でほぼ同時期に分離された菌株は、熱抵抗性の上で大きく2つに分類された。また、50℃10分間加熱した菌株は、塩酸に対して抵抗性を有するようになった。
(2)Vibrio parahaemolyticusの熱抵抗性ならびに凍結に伴う菌の生残動態
近年日本で分離されたVibrio parahaemolyticus菌株を用い、熱抵抗曲線の近似式を求めた。さらに、凍結に弱いとされているV. parahaemolyticusが、検食システムにより食品中で凍結保存された場合、どのような生菌数の変化が起こるのかを推定するために、食品に接種した菌数の凍結後の変化を測定した。ホタテとアオヤギに接種したV. parahaemolyticusは0時から1日後まで、急激に10～104個低下し、その後緩慢に減少していった。
3.Exposure Assessmentのための基礎知見としての、調理過程における二次汚染のモデル化に関する研究
(1)手指を介した一般生菌ならびに大腸菌群の移行動態
二次汚染を、手指を介する場合と調理器具表面を介する場合とに分け、定量実験を行った。手指を介する場合として、さらに、調理実習中の原材料から手指への一般生菌ならびに大腸菌群の移行と、手指に塗布された既知量の大腸菌の生食用食材への移行の2ステップについて、それぞれデータを採取した。
調理実習において、初期菌数の高い鶏挽肉ともやしをそれぞれ下処理した際、食材ごとに一定した割合で、一般生菌も大腸菌群も手指へ移行することがわかった。菌数測定に関する検出効率も勘案しつつ、これら移行率ならびに手指から生食用食材への移行率について、確率分布を考慮したモデリングを行った。
(2)調理器具表面を介したSalmonella Enteritidisの移行動態
(1)と同様に、調理器具表面を介する二次汚染のモデリングのための実験を行った。Salmonella Enteritidisによって汚染された卵液が調理台上にこぼれ、それを拭き取ったふきんによって食卓表面に塗布され、食卓上に落下した食品を介して最終的に摂食される、というシナリオを想定した。各段階でSalmonella Enteritidisの菌数を測定して確率論的モデリングを行った。
4.腸炎ビブリオの東南アジアでの流行実態、及び日本での汚染実態調査。
(1)世界的大流行を起こしている腸炎ビブリオの新型クローンによる感染症発生状況、魚介類の汚染状況、および両者の相関関係を明らかにするための研究を実施した。本クローンによる感染症が多発するタイ南部ソンクラ地区の2つの市中病院で下痢患者糞便を検査したところ、1年間で317検体から腸炎ビブリオを分離できた。そのうち242検体(76%)に由来する菌株が新型クローンに属しており、この地域では新型クローンによる感染症が多発していることが明らかになった。新型クローンの血清型はO3:K6型(80%)、O4:K68型(8.4%)O1:K25型(6.9%)、O1:KUT型(1.8%)、O1:K41型(0.32%)、O4:K12型(0.32%)であり、従来報告されていた血清型分布より多様であることが明らかになった。一方同地域で市販されている新鮮魚介類中の新型腸炎ビブリオの分布を検査した。検査は免疫磁気ビーズ法を取り入れた方法で、1998年から2000年度までの検査では、魚介類のうち貝類からのみ目的の新型クローンが分離できた(検査総数284検体のうち貝類136検体、陽性貝類4検体)ので、2001年度は、貝類を中心に検査した(検査総数132検体のうち貝類136検体)。その結果7検体が陽性であった。したがって、タイ南部ソンクラ地区の海洋環境中には高頻度で新クローンが分布していると考えられる。また2001年度に分離した新型クローン菌株の血清型は、O3:K6型5株、O3:KUT型1株、およびO1:K25型1株であった。これらの血清型分布は患者分離新型クローン菌株の血清型分布と強い相関関係を示しており、現地で漁獲・販売されている貝類が感染症の原因食品であることを示唆していると言える。
(2)市販の岩がき78検体中7検体から、採取された後冷蔵温度下で運搬されたアオヤギ29袋のうち7袋から、流通市場で販売されていたアオヤギ31検体中4検体から、それぞれtdh遺伝子が検出された。冷蔵保管と30℃保管との比較実験等の成績から、低温管理されない場合には、毒素産生株が検出されやすくなることが示された。腸炎ビブリオとtdh陽性腸炎ビブリオの両者の菌数比較の結果、14検体のうち4検体については、腸炎ビブリオ総菌数がtdh陽性腸炎ビブリオ菌数の1000倍以上、9検体については100倍以上、すべての検体について10倍以上であることが認められた。
(3)腸炎ビブリオO3K6とその他の株について、海水、人工海水、10倍希釈人工海水における生残菌数を20℃および5℃下で逐次的に計測した。その結果いずれの株も、低温下における方が死滅しやすいこと、いずれの温度においてもO3K6とその他の株間で顕著な差異は認められなかったことから、近年O3:K6株が優勢となったことは、海水中での生残における他株との相違によるものではないものと考えられた。
5.SRSVの検出法の開発、発生動向および検出動向調査。
(1)ノーウォーク様ウイルス(NLV)に特異的な抗体を結合した磁気ビーズを調製し、推定原因食品からNLVを回収した後にRT-PCRを実施し、NLVを検出することを試みた。食中毒患者の糞便検体を用いたRT-PCRと抗原検出ELISAの検査成績から、Chiba型NLVの関与が推定された食中毒事件において、本法でNLVの検出をおこなったところ、残品食品9品目のうちの2品目からNLV遺伝子を検出することができた。また、遺伝子解析の結果、食中毒患者糞便と食品に由来するNLVは互いに極めて近縁なNLVであることが確認された。磁気ビーズを利用した免疫捕獲 RT-PCR法は、多数の検体の迅速処理が可能であり、かつ簡便なNLVの検出法として食中毒検査には有用な方法であると考えられた。
(2)ノーウォークウイルスのリスク評価の基礎データを得る目的で、カキによる食中毒発生原因食品カキ、市販生カキのNV汚染状況、カキ養殖海域の海水とカキのNV汚染状況、リアルタイムPCR法の検討を行なった。原因カキでは半分の事例からカキ1個当たりNV200コピー以上の汚染が認められた。市販生カキでは15%に200コピー/個以上の汚染が明らかとなり、1月、2月にNV汚染されているカキの比率が高く、且つNV量も多いことが明らかとなった。海水とカキの汚染では明らかな関連性は見出せなかったが、今後調査方法の検討が必要である。リアルタイムPCR法は低い価での再現性に問題があり、今後、検出感度を高めると共に、診断基準の作成が必要である。
6.BSEの調査
屠畜場に搬入された反すう動物の内、神経症状が疑われた牛及び1.5歳以上の羊の中枢神経組織からプリオン検出を実施した。新鮮組織の場合はウエスタンブロット、固定組織の場合は免疫染色を行った。
10月18日からは屠畜場に搬入された牛は全頭検査を行うこととなったため、牛検体はまず都道府県でELISA法による一次検査がおこなわれ、陽性となったものが確定検査のために送付されてくる。
羊は現在までに23検体、牛は全頭検査実施までに検査した204検体すべてが陰性であった。この間、5月に屠畜場外で発生したスクレイピー1例を摘発した。
牛は11月末までに126,911頭が検査され、北海道及び埼玉で各1例、合計2例の陽性牛が摘発された。
一方、確定診断の診断のための検査法の時間短縮と感度向上を目的とした改良を加え検査法のプロとコールを完成した。
結果と考察
結論
1.家庭での卵の生食に伴うSalmonella Enteritidis感染のリスクアセスメントは、種々の制限はあるものの、日本で初めての確率論的アセスメントであった。
2.Exposrure assessmentのための予測微生物学的研究では、腸管出血性大腸菌並びに腸炎ビブリオに関する耐熱性および耐酸性に関する予測式は今後のExposure assessmentに利用可能と考えられた。
3.Exposure assessmentのための二次汚染モデルに関する研究では、種子への以降を確立論的数式によって表現することが可能となった。
4.腸炎ビブリオの汚染実態調査において、東南アジアでは新型クローンが発見された。日本においては、岩カキからtdh遺伝子陽性株が検出された。さらに、定量データの収集が必要と考えられた。
5.SRSVの検出には、免疫ビーズを用いたPCR法が有効であることが示唆された。
また、汚染実態調査は今後検出法を検討しながらも継続する必要があると考えられた。6.BSE検査で3頭の牛が陽性となった。今後も継続する必要があると考えられた。
2.Exposrure assessmentのための予測微生物学的研究では、腸管出血性大腸菌並びに腸炎ビブリオに関する耐熱性および耐酸性に関する予測式は今後のExposure assessmentに利用可能と考えられた。
3.Exposure assessmentのための二次汚染モデルに関する研究では、種子への以降を確立論的数式によって表現することが可能となった。
4.腸炎ビブリオの汚染実態調査において、東南アジアでは新型クローンが発見された。日本においては、岩カキからtdh遺伝子陽性株が検出された。さらに、定量データの収集が必要と考えられた。
5.SRSVの検出には、免疫ビーズを用いたPCR法が有効であることが示唆された。
また、汚染実態調査は今後検出法を検討しながらも継続する必要があると考えられた。6.BSE検査で3頭の牛が陽性となった。今後も継続する必要があると考えられた。
公開日・更新日
公開日
-
更新日
-