文献情報
文献番号
200100849A
報告書区分
総括
研究課題名
特定疾患の分子病態の解明に関する研究(総括研究報告書)
課題番号
-
研究年度
平成13(2001)年度
研究代表者(所属機関)
永井 良三(東京大学大学院医学系研究科、循環器内科)
研究分担者(所属機関)
- 永井良三(東京大学大学院医学系研究科、循環器内科)
- 西川伸一(京都大学医学研究科分子遺伝学部門・免疫学、発生学)
- 中福雅人(東京大学大学院医学系研究科神経生物学・分子神経生物学)
- 千葉 滋(東京大学大学院医学系研究科・血液内科学)
- 宮園浩平(東京大学大学院医学系研究科・生化学部)
- 中村敏一(大阪大学大学院医学系研究科附属バイオメディカル教育研究センター腫瘍医学部門分子細胞生物学)
- 上野 光(産業医科大学・生化学)
- 門脇 孝(東京大学大学院医学研究科糖尿病・代謝内科)
- 小室一成(千葉大学医学部・第三内科)
- 森下竜一(大阪大学大学院医学系研究科・遺伝子治療学)
研究区分
厚生科学研究費補助金 先端的厚生科学研究分野 特定疾患対策研究事業
研究開始年度
平成11(1999)年度
研究終了予定年度
平成13(2001)年度
研究費
38,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
特定疾患の基本病態として、原因不明の炎症、間質細胞の活性化、線維化、血管障害などが大きく関与する。したがって線維化や血行障害、さらに細胞分化の分子機構を明かにし、これらの分子病態に基づいた治療法を開発することにより、特定疾患の新たな治療戦略の構築が可能となる。
本研究は特定疾患の病態解明と新しい治療法の開発を目指し、(1)神経、血球、心血管細胞の分化機構と幹細胞による再生療法の開発、(2)炎症のメカニズムと間質細胞の活性化および線維化の分子機構、(3)血管障害の分子機構と血管保護療法の開発を目的とする。
本研究は再生医学や血管医学の視点から、特定疾患の病態を解明すると共に、新しい治療法の開発を目指している。同時に、間質細胞の活性化や線維化、炎症の分子機構に基づいた治療法の開発も重要な目的とする。
本研究は特定疾患の病態解明と新しい治療法の開発を目指し、(1)神経、血球、心血管細胞の分化機構と幹細胞による再生療法の開発、(2)炎症のメカニズムと間質細胞の活性化および線維化の分子機構、(3)血管障害の分子機構と血管保護療法の開発を目的とする。
本研究は再生医学や血管医学の視点から、特定疾患の病態を解明すると共に、新しい治療法の開発を目指している。同時に、間質細胞の活性化や線維化、炎症の分子機構に基づいた治療法の開発も重要な目的とする。
研究方法
永井は、血管障害の分子機構と血管保護療法について検討した。西川は、ES細胞を用いた試験管内血管形成について検討した。中福は、神経幹細胞を用いた神経組織の再生・修復のための新規治療の開発について検討した。千葉は、効率的造血再生を目指すための基礎について検討した。宮園は、Smadによる血管内皮細胞の増殖分化調節機構について検討した。中村は、HGF蛋白ならびにHGF遺伝子による難治性疾患の治療とその作用機構について検討した。上野は、臓器繊維症の病態解明と新規治療法について検討した。森下は、動脈硬化形成における炎症の関与の解明と治療への応用について検討した。門脇は、PPARγアゴニストを用いた炎症細性腸疾患の新しい治療法の確立について検討した。小室は、BMPによる心筋細胞分化誘導の機序について検討した。
結果と考察
・永井:血管障害の分子機構と血管保護療法について検討した。血管細胞と間質細胞に発現し、血管病態、血管新生、炎症に関与する転写因子BTEB2/IKLFのノックアウトマウスを作製・解析し、同因子は心血管系を中心としたリモデリング(臓器繊維化、炎症・修復)に関与することが明らかになった。PDGF-A、TGFβが下流遺伝子に位置する。また、レチノイド系化合物で形質が回復し、治療への発展の糸口となる。さらにBTEB2/IKLFの相互作用制御因子を精製・同定の結果、癌関連制御因子SETが含まれ、同因子はBTEB2/IKLFによるPDGF-Aの転写活性を抑えた。また、klothoと血管新生の関係について検討した。klotho欠損マウスの下肢虚血モデルでは血管新生能が低下しており、klothoが血管新生に関与していることを示した。
・西川:試験管内血管構築形成について検討した結果、血管内皮と平滑筋共通の前駆細胞を同定し、平滑筋非存在下で内皮のリモデリングを誘導する実験系を確立した。また、ES細胞由来の血管内皮を移植し血管ネットワークを作成し、GFPを結合させた各種キメラ遺伝子を導入したES細胞から分化した内皮細胞を用いて、Ang1,VEGF-cの細胞レベルでの機能を明らかにした。
・中福:成体中枢神経組織に内在する神経幹細胞、前駆細胞を操作することにより損傷組織の修復、再生について検討した。脊髄切断損傷および大脳海馬領域の虚血性損傷における内在性神経前駆細胞の再生能について検討した結果、神経前駆細胞が成体脊髄実質部に広範に存在することを明らかにし、神経前駆細胞が損傷に応答して組織内で増殖することを見出した。ニューロン新生の制限機構にNotch受容体のシグナル伝達系が関与していた。
・千葉: Notchリガンドによる造血制御について検討した結果、活性型Notchによる造血細胞の分化抑制を観察し、Notch1による造血細胞の分化抑制は、GATA2の発現維持を介していた。Notch1ノックアウトマウスで造血細胞の発生におけるNotchの役割を解析した結果、P-Spより血管内皮細胞は形成されたが、造血細胞は形成されなかった。しか し、YS細胞の血球コロニー形成能は保たれていた。Notchシグナル分子であるHES-1導入造血幹細胞は、造血再構築可能な 造血幹細胞を、試験管内で短期間維持した。
・宮園:Smadの転写活性について検討した結果、抑制型SmadであるSmad6とSmad7のうち、TGF-βシグナルの抑制はSmad7の方が強力であった。内皮細胞にTGF-βのI型レセプターALK-1とALK-5をそれぞれ発現させたところ抑制型Smadとendoglin(ALK-1の場合)が誘導された。BMP II型レセプターの細胞外領域や細胞内キナーゼ領域に変異を導入するとシグナルの喪失が見られた。一方、C末端のtail領域の変異ではシグナル伝達能の変化は少なかった。
・中村:難治性疾患モデル動物にリコンビナントHGFタンパク質ならびにHGF遺伝子発現プラスミドを投与し、その治療効果とその作用機構の解析を行った。急性疾患としては劇症肝炎と心筋梗塞に関してリコンビナントHGF投与により、ドラマチックな発症阻止と治療効果が得られた。この治療効果はHGFの強力な抗アポトーシス作用と実質細胞の再生促進効果によることが明らかになった。一方、慢性疾患では肝硬変、慢性腎不全/腎硬化症、拡張型心筋症に対してリコンビナントHGFならびにHGF遺伝子治療が顕著な進行阻止と治療効果を発揮した。
・上野:炎症と繊維化のメカニズムと防止について検討した結果、TGF-βの作用を特異的に抑制する変異型TGF-β受容体を作成したアデノウイルスを導入すると、線維化の発症さらに進展も抑制され、かつ臓器機能の保存と生存がみられた。肝線維化の他、腎硬化症、角膜混濁、肺線維症そして糖尿病性動脈硬化症の各モデルでも同様の効果が観察された。
・森下:バルーン障害によりブタ冠動脈バルーン障害後再狭窄モデルを作成し、NFkBデコイの血管内投与を行い、新生内膜形成について検討した。NFkBデコイの投与は、新生内膜の形成を有意に抑制した。また、他の炎症性疾患への応用を進め、慢性関節リウマチサルモデルにおいて、NFkBデコイの関節内投与による腫脹の軽減・骨破壊抑制を明らかにした。更に、アトピー性皮膚炎モデルマウスに対して軟膏製剤を開発した結果、著明な皮膚症状の改善を認めた。
・門脇:虚血再潅流腸管傷害におけるPPARγの役割ついて検討した結果、PPARγリガンド前投与で虚血再潅流胃・腸管傷害が抑制された。機序としてNF-kB活性化阻害が示された。DSS誘発腸炎でも同剤前投与は傷害を抑制し、治療群で腸でのTh1抑制、Th2活性化をみた。PPARγ欠損マウスは傷害が強く、またリガンドの後治療では傷害抑制は認めなかった。
・小室:in vitro心筋細胞分化系によりBMPが心筋細胞分化を促進する機序、心筋特異的転写因子Csx/Nkx2.5の分化した心筋細胞における役割について検討した。BMP阻害分子nogginを過剰発現させて心筋分化能を失活させたP19CL6noggin細胞はBMP、TAK、smad1/4の強制発現により心筋に分化した。BMP、BMPの下流に存在するTAK、smad、その下流のATF-2の役割について検討した結果、ATF-2はTAK、smad1/4と協調的にβMHCプロモーター活性を上昇させた。変異Csx/Nkx2.5を過剰発現させたP19CL6細胞、Csx/Nkx2.5変異マウスでは酸化ストレスによるapoptosisが増加した。BMPの心筋細胞分化機構とCsx/Nkx2.5の心筋保護作用が明らかになった。
・西川:試験管内血管構築形成について検討した結果、血管内皮と平滑筋共通の前駆細胞を同定し、平滑筋非存在下で内皮のリモデリングを誘導する実験系を確立した。また、ES細胞由来の血管内皮を移植し血管ネットワークを作成し、GFPを結合させた各種キメラ遺伝子を導入したES細胞から分化した内皮細胞を用いて、Ang1,VEGF-cの細胞レベルでの機能を明らかにした。
・中福:成体中枢神経組織に内在する神経幹細胞、前駆細胞を操作することにより損傷組織の修復、再生について検討した。脊髄切断損傷および大脳海馬領域の虚血性損傷における内在性神経前駆細胞の再生能について検討した結果、神経前駆細胞が成体脊髄実質部に広範に存在することを明らかにし、神経前駆細胞が損傷に応答して組織内で増殖することを見出した。ニューロン新生の制限機構にNotch受容体のシグナル伝達系が関与していた。
・千葉: Notchリガンドによる造血制御について検討した結果、活性型Notchによる造血細胞の分化抑制を観察し、Notch1による造血細胞の分化抑制は、GATA2の発現維持を介していた。Notch1ノックアウトマウスで造血細胞の発生におけるNotchの役割を解析した結果、P-Spより血管内皮細胞は形成されたが、造血細胞は形成されなかった。しか し、YS細胞の血球コロニー形成能は保たれていた。Notchシグナル分子であるHES-1導入造血幹細胞は、造血再構築可能な 造血幹細胞を、試験管内で短期間維持した。
・宮園:Smadの転写活性について検討した結果、抑制型SmadであるSmad6とSmad7のうち、TGF-βシグナルの抑制はSmad7の方が強力であった。内皮細胞にTGF-βのI型レセプターALK-1とALK-5をそれぞれ発現させたところ抑制型Smadとendoglin(ALK-1の場合)が誘導された。BMP II型レセプターの細胞外領域や細胞内キナーゼ領域に変異を導入するとシグナルの喪失が見られた。一方、C末端のtail領域の変異ではシグナル伝達能の変化は少なかった。
・中村:難治性疾患モデル動物にリコンビナントHGFタンパク質ならびにHGF遺伝子発現プラスミドを投与し、その治療効果とその作用機構の解析を行った。急性疾患としては劇症肝炎と心筋梗塞に関してリコンビナントHGF投与により、ドラマチックな発症阻止と治療効果が得られた。この治療効果はHGFの強力な抗アポトーシス作用と実質細胞の再生促進効果によることが明らかになった。一方、慢性疾患では肝硬変、慢性腎不全/腎硬化症、拡張型心筋症に対してリコンビナントHGFならびにHGF遺伝子治療が顕著な進行阻止と治療効果を発揮した。
・上野:炎症と繊維化のメカニズムと防止について検討した結果、TGF-βの作用を特異的に抑制する変異型TGF-β受容体を作成したアデノウイルスを導入すると、線維化の発症さらに進展も抑制され、かつ臓器機能の保存と生存がみられた。肝線維化の他、腎硬化症、角膜混濁、肺線維症そして糖尿病性動脈硬化症の各モデルでも同様の効果が観察された。
・森下:バルーン障害によりブタ冠動脈バルーン障害後再狭窄モデルを作成し、NFkBデコイの血管内投与を行い、新生内膜形成について検討した。NFkBデコイの投与は、新生内膜の形成を有意に抑制した。また、他の炎症性疾患への応用を進め、慢性関節リウマチサルモデルにおいて、NFkBデコイの関節内投与による腫脹の軽減・骨破壊抑制を明らかにした。更に、アトピー性皮膚炎モデルマウスに対して軟膏製剤を開発した結果、著明な皮膚症状の改善を認めた。
・門脇:虚血再潅流腸管傷害におけるPPARγの役割ついて検討した結果、PPARγリガンド前投与で虚血再潅流胃・腸管傷害が抑制された。機序としてNF-kB活性化阻害が示された。DSS誘発腸炎でも同剤前投与は傷害を抑制し、治療群で腸でのTh1抑制、Th2活性化をみた。PPARγ欠損マウスは傷害が強く、またリガンドの後治療では傷害抑制は認めなかった。
・小室:in vitro心筋細胞分化系によりBMPが心筋細胞分化を促進する機序、心筋特異的転写因子Csx/Nkx2.5の分化した心筋細胞における役割について検討した。BMP阻害分子nogginを過剰発現させて心筋分化能を失活させたP19CL6noggin細胞はBMP、TAK、smad1/4の強制発現により心筋に分化した。BMP、BMPの下流に存在するTAK、smad、その下流のATF-2の役割について検討した結果、ATF-2はTAK、smad1/4と協調的にβMHCプロモーター活性を上昇させた。変異Csx/Nkx2.5を過剰発現させたP19CL6細胞、Csx/Nkx2.5変異マウスでは酸化ストレスによるapoptosisが増加した。BMPの心筋細胞分化機構とCsx/Nkx2.5の心筋保護作用が明らかになった。
結論
特定疾患の病態解明と新しい治療法の開発を目指し、(1)神経、血球、心血管細胞の分化機構と幹細胞による再生療法の開発、(2)炎症のメカニズムと間質細胞の活性化および線維化の分子機構、(3)血管障害の分子機構と血管保護療法の開発を目的とした研究を行った。
上記3プロジェクト全てについて成果をあげた。1)神経、血球、心血管細胞の分化機構と幹細胞による再生療法の開発の場合、西川による血管の再構築系の確立、中福による神経幹細胞の試験管内での培養・維持、さらに小室による心筋分化パスウエーの解明等が主な成果である。2)炎症のメカニズムと間質細胞の活性化および線維化の分子機構の場合、上野のSmadの調節を通した繊維化の抑制、中村によるHGF投与による心筋梗塞再灌流障害の治療などが主な成果である。門脇による炎症性腸疾患、胃虚血再灌流障害に対するPPARγを用いた新しい治療法の開発も重要である。3)血管障害の分子機構と血管保護療法の開発を目的とした研究の場合、森下による転写因子NFkBに対するデコイ導入によるバルーン傷害後再狭窄抑制、永井らによるklothoの遺伝子導入による血管機能の改善効果、動脈硬化性新生内膜の起源細胞の同定、さらに宮園によるTGF-βシグナルの血管機能維持における役割の解明などが主な成果である。以上のように、特定疾患の分子病態の解明および治療の開発に関わる成果をあげることができた。
上記3プロジェクト全てについて成果をあげた。1)神経、血球、心血管細胞の分化機構と幹細胞による再生療法の開発の場合、西川による血管の再構築系の確立、中福による神経幹細胞の試験管内での培養・維持、さらに小室による心筋分化パスウエーの解明等が主な成果である。2)炎症のメカニズムと間質細胞の活性化および線維化の分子機構の場合、上野のSmadの調節を通した繊維化の抑制、中村によるHGF投与による心筋梗塞再灌流障害の治療などが主な成果である。門脇による炎症性腸疾患、胃虚血再灌流障害に対するPPARγを用いた新しい治療法の開発も重要である。3)血管障害の分子機構と血管保護療法の開発を目的とした研究の場合、森下による転写因子NFkBに対するデコイ導入によるバルーン傷害後再狭窄抑制、永井らによるklothoの遺伝子導入による血管機能の改善効果、動脈硬化性新生内膜の起源細胞の同定、さらに宮園によるTGF-βシグナルの血管機能維持における役割の解明などが主な成果である。以上のように、特定疾患の分子病態の解明および治療の開発に関わる成果をあげることができた。
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