文献情報
文献番号
200100677A
報告書区分
総括
研究課題名
人工ポリクローナルFvグロブリン製剤の開発に関する研究(総括・分担研究報告書)
課題番号
-
研究年度
平成13(2001)年度
研究代表者(所属機関)
鈴木 和男(国立感染症研究所)
研究分担者(所属機関)
- 新井孝夫(東京理科大学)
- 佐々木次雄(国立感染症研究所)
- 田之倉優(東京大学)
- 大野尚仁(東京薬科大学)
- 武曾恵理(北野病院)
- 高橋啓(東邦大学)
- 岡崎富男(広島市民病院)
研究区分
厚生科学研究費補助金 先端的厚生科学研究分野 高度先端医療研究事業（人工血液開発研究分野）
研究開始年度
平成12(2000)年度
研究終了予定年度
平成14(2002)年度
研究費
10,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
血管炎やリウマチなど生体防御異常による自己免疫疾患が増加しており、その発症機構や治癒機転は明確になっていない。そのため、治療はステロイドパルスなどによっていることから、高齢者や重篤な患者には危険性が高く、新たな治療法の開発が強く望まれている。最近、ヨーロッパではその治療としてガンマグロブリン製剤(IVIG)の有効性が報告されている。その導入要因には、MPO(myeloperoxidase)-ANCA関連血管炎のように、対応抗原が解明され、IVIG療法とMPO-ANCA抗体との関連を解明する手がかりが明らかになりつつあるのも背景にある。
これまで、主任研究者らは、好中球の異常機能に着目して血管炎の病因の解明と予防・治療法に焦点をあて、自己抗体の病因性エピトープの同定および自己抗体産生のモデルマウス(川崎病および腎炎)を検討し、病因解明への糸口を見いだした。本疾患は、好中球の分子MPOに対する抗体(MPO-ANCA)を産生することから、MPOのH鎖のNおよびC末端に反応するエピトープをもつMPO-ANCA抗体が重症化と関連し、特定の反応部位が病態と関連することを認めた。この結果から、MPO-ANCAのクロナリテイーが血管炎疾患および病態と関連があることが示唆され、新しい治療・病態評価法の指針を提示した。本研究において、本年度は、自己免疫疾患MPO-ANCA関連血管炎のIVIG治療の評価を検討した。
一方、血管炎などの療法の開発や病因の解析には、自己抗体を産生するモデルマウスを用いた研究や治療法が課題となっている。そのモデル動物としては、NZB/WF1、MRL/lpr、SCG/Kj、IRF-8/ICSBPマウスおよびCandida albicans 由来物質誘発の冠状動脈炎マウスなどが利用できる状況がある。本研究において、これらのマウスにおいてMPOがどの様に関与しているかを解明するとともに、MPO-ANCA産生モデルマウスでの治療の有効性を検討した。さらに、これらモデルマウスでのガンマグロブリン治療の評価を予備的に施行するとともに、新たなモデルマウスとして半月体形成性糸球体腎炎自然発症のSCG/Kjマウスの有用性を腎炎発症と好中球機能から検討した。
本研究は、最終的には、人工ガンマグロブリン開発をめざしていることから、MPO-KOマウスを用いて、マウスMPO特異的抗体産生ハイブリドーマを作製するとともに、その脾臓細胞のmRNAからMPO抗体遺伝子をクローニングし、人工ScFv抗体を作製する系をすでに構築し準備が整っている。
以上のように、血管炎治療に主眼をおいて、治癒機転が不明なガンマグロブリン製剤の欠点を最小限に抑えるとともに、大量に安定供給が可能な利点を利用出来る人工ガンマグロブリン作製することを最終目的とする。
これまで、主任研究者らは、好中球の異常機能に着目して血管炎の病因の解明と予防・治療法に焦点をあて、自己抗体の病因性エピトープの同定および自己抗体産生のモデルマウス(川崎病および腎炎)を検討し、病因解明への糸口を見いだした。本疾患は、好中球の分子MPOに対する抗体(MPO-ANCA)を産生することから、MPOのH鎖のNおよびC末端に反応するエピトープをもつMPO-ANCA抗体が重症化と関連し、特定の反応部位が病態と関連することを認めた。この結果から、MPO-ANCAのクロナリテイーが血管炎疾患および病態と関連があることが示唆され、新しい治療・病態評価法の指針を提示した。本研究において、本年度は、自己免疫疾患MPO-ANCA関連血管炎のIVIG治療の評価を検討した。
一方、血管炎などの療法の開発や病因の解析には、自己抗体を産生するモデルマウスを用いた研究や治療法が課題となっている。そのモデル動物としては、NZB/WF1、MRL/lpr、SCG/Kj、IRF-8/ICSBPマウスおよびCandida albicans 由来物質誘発の冠状動脈炎マウスなどが利用できる状況がある。本研究において、これらのマウスにおいてMPOがどの様に関与しているかを解明するとともに、MPO-ANCA産生モデルマウスでの治療の有効性を検討した。さらに、これらモデルマウスでのガンマグロブリン治療の評価を予備的に施行するとともに、新たなモデルマウスとして半月体形成性糸球体腎炎自然発症のSCG/Kjマウスの有用性を腎炎発症と好中球機能から検討した。
本研究は、最終的には、人工ガンマグロブリン開発をめざしていることから、MPO-KOマウスを用いて、マウスMPO特異的抗体産生ハイブリドーマを作製するとともに、その脾臓細胞のmRNAからMPO抗体遺伝子をクローニングし、人工ScFv抗体を作製する系をすでに構築し準備が整っている。
以上のように、血管炎治療に主眼をおいて、治癒機転が不明なガンマグロブリン製剤の欠点を最小限に抑えるとともに、大量に安定供給が可能な利点を利用出来る人工ガンマグロブリン作製することを最終目的とする。
研究方法
1) MPO-ANCA関連血管炎症:8例全例とも治療前腎生検を施行し、組織学的にANCA関連腎炎あるいは血管炎と診断した。腎生検後、初期治療としてIVIG 400mg/kg/day, 5日間の治療を施行した後、経口ステロイド療法あるいは経口cyclophosphaminde投与を行った。臨床的治療効果判定はBirmingham vasculitis activity score (BVAS)によった。
2) IVIG治療前後に好中球機能を測定した。
3) 広島市民病院に入院した川崎病患者を対象とした。
4) 菌体抽出物(CADS)誘導血管炎モデルマウス:第1および第5週目にCADSをマウス腹腔に接種、第9週目に屠殺・剖検後、病理組織学的に血管炎の組織像を検討した。
5) CADS誘導血管炎モデルマウスに、ヒト免疫グロブリンおよびhigh MPO-ANCA titer IgGを腹腔内投与し、血管炎発生効果を組織学的に評価した。
6) 血管炎自然発症モデルマウス:半月体形成性糸球体腎炎発症のSCG/Kjマウスの腎炎発症と好中球機能を測定した。
7) マウスのリコンビナントMPO(rmMPO)の調製: mMPOを E. coliにて発現・精製し、native mMPOは腹腔好中球より調製した。
8) 菌体外多糖(CAWS)の調整:C. albicansの培養外液をエタノール沈殿することでCAWSを得た。
9) 脾臓細胞、血管内皮細胞、株化細胞を培養し、細胞外へのサイトカイン産生をサンドイッチELISA法により測定した。
10) モノクローナル抗体:ヒトMPOを足蹠に3日毎に3回注射する方法およびMPOノックアウトマウスにマウスリコンビナントMPOを注射する2つの方法により作製した。
11) 抗体の性質は、未変性MPOとの反応性、MPO活性の阻害能、エピトープの相違について解析した。
12) MPOの構造情報から特定された相互作用部位の情報をもとに分子モデリングを行い、MPOとMPO-ANCAの結合様式を求めた。
2) IVIG治療前後に好中球機能を測定した。
3) 広島市民病院に入院した川崎病患者を対象とした。
4) 菌体抽出物(CADS)誘導血管炎モデルマウス:第1および第5週目にCADSをマウス腹腔に接種、第9週目に屠殺・剖検後、病理組織学的に血管炎の組織像を検討した。
5) CADS誘導血管炎モデルマウスに、ヒト免疫グロブリンおよびhigh MPO-ANCA titer IgGを腹腔内投与し、血管炎発生効果を組織学的に評価した。
6) 血管炎自然発症モデルマウス:半月体形成性糸球体腎炎発症のSCG/Kjマウスの腎炎発症と好中球機能を測定した。
7) マウスのリコンビナントMPO(rmMPO)の調製: mMPOを E. coliにて発現・精製し、native mMPOは腹腔好中球より調製した。
8) 菌体外多糖(CAWS)の調整:C. albicansの培養外液をエタノール沈殿することでCAWSを得た。
9) 脾臓細胞、血管内皮細胞、株化細胞を培養し、細胞外へのサイトカイン産生をサンドイッチELISA法により測定した。
10) モノクローナル抗体:ヒトMPOを足蹠に3日毎に3回注射する方法およびMPOノックアウトマウスにマウスリコンビナントMPOを注射する2つの方法により作製した。
11) 抗体の性質は、未変性MPOとの反応性、MPO活性の阻害能、エピトープの相違について解析した。
12) MPOの構造情報から特定された相互作用部位の情報をもとに分子モデリングを行い、MPOとMPO-ANCAの結合様式を求めた。
結果と考察
12年度は、ScFvおよびFullガンマグロブリン作製の方法を確立したので、本年度は、臨床成績のまとめを行うとともに、治療効果を評価する系を確立した。
1.臨床、モデル動物班
1)ANCA関連腎炎及び血管炎の好中球機能の検討とガンマグロブリン療法の効果に関する研究
MPO-ANCA関連腎炎症例8例に本療法を施行し、前例で臨床所見、炎症症状、腎病変のいずれかの改善を見、更に一部では、ステロイド剤の用量を著明に減量できた。IVIGは現在増えつつあるMPO-ANCA関連腎炎症候群の有力な補助療法として試みられるべき治療と考えられる。
2)小児臨床におけるガンマグロブリン治療の評価
10年7ヶ月間の広島市民病院における川崎病の臨床的検討を行った。診断基準を満たす症例は220例で、206例にガンマグロブリンを施行した。ガンマグロブリン無効例の19%は冠動脈病変を認め、急性期治療に難渋したガンマグロブリン無効例では、冠動脈病変が多かった。
3)KADSによるマウス系統的血管炎誘発モデルを用いた免疫グロブリン投与による血管炎発生への影響の予備的検討
本血管炎モデルを用い、ヒト免疫グロブリンが血管炎発生に与える影響を検討し、弱いながら抑制した。
4)MPO-ANCAおよび好中球機能異常を示す自然発症血管炎動物モデルの検討
腎炎や血管炎を自然発症するNZB/WF1、MRL/lpr、SCG/Kj、IRF-8/ICSBPマウスがあり、なかでも、半月体形成性糸球体腎炎を高率かつ急速に自然発症するSCG/Kjマウスを用いて、好中球機能、MPO-ANCA産生と、腎炎進行との相関を検討した。腎炎の初期段階においてMPOの易放出性を認め、活性化状態であることを示した。
5)真菌由来多糖(CAWS)による自己抗体の産生誘導機構の解析
C. albicansの培養上清からmannoprotein-β-glucan複合体のCAWSを得、マウスに接種し、冠状動脈血管炎の発症と発症機序を解析した。また、抗MPO抗体をin vitro培養系にて効果を評価した。CAWS 、C3Hマウスにおいて全例発症し、培養細胞に対する直接障害作用、サイトカイン産生抑制作用,血小板凝集促進作用、血管内皮細胞機能を示した。CAWSの冠状動脈血管炎誘発活性の特徴を明確にすると共に、抗MPO抗体の活性修飾作用を検討した。
2.抗体作製班
1)MPO-ANCA自己免疫疾患治療に有効な抗体作製に関する研究
ヒトMPOを免疫した正常マウスとマウスMPOを免疫したMPOノックアウトマウスの脾臓B細胞から、それそれ1種類と32種類の抗MPOモノクローナル抗体を作製した。2種類の抗体の性質を解析し、両抗体ともに未変性のMPOと反応し、競合ELISAにより、両抗体の認識するエピトープが異なっていた。本知見は、MPO-ANCA自己免疫疾患モデルマウスに対する抗MPO抗体の治療効果の評価に有用と思われる。
2)MPOの立体構造に関する研究
立体構造上の特徴とMPOフラグメントのリスクの実験結果と比較することにより、MPO上のMPO-ANCAとの分子間相互作用部位を特定した。MPOのMPO-ANCA結合部位はMPOの活性部位周辺の溶媒に露出したループおよびαヘリックスであることが予測された。
1.臨床、モデル動物班
1)ANCA関連腎炎及び血管炎の好中球機能の検討とガンマグロブリン療法の効果に関する研究
MPO-ANCA関連腎炎症例8例に本療法を施行し、前例で臨床所見、炎症症状、腎病変のいずれかの改善を見、更に一部では、ステロイド剤の用量を著明に減量できた。IVIGは現在増えつつあるMPO-ANCA関連腎炎症候群の有力な補助療法として試みられるべき治療と考えられる。
2)小児臨床におけるガンマグロブリン治療の評価
10年7ヶ月間の広島市民病院における川崎病の臨床的検討を行った。診断基準を満たす症例は220例で、206例にガンマグロブリンを施行した。ガンマグロブリン無効例の19%は冠動脈病変を認め、急性期治療に難渋したガンマグロブリン無効例では、冠動脈病変が多かった。
3)KADSによるマウス系統的血管炎誘発モデルを用いた免疫グロブリン投与による血管炎発生への影響の予備的検討
本血管炎モデルを用い、ヒト免疫グロブリンが血管炎発生に与える影響を検討し、弱いながら抑制した。
4)MPO-ANCAおよび好中球機能異常を示す自然発症血管炎動物モデルの検討
腎炎や血管炎を自然発症するNZB/WF1、MRL/lpr、SCG/Kj、IRF-8/ICSBPマウスがあり、なかでも、半月体形成性糸球体腎炎を高率かつ急速に自然発症するSCG/Kjマウスを用いて、好中球機能、MPO-ANCA産生と、腎炎進行との相関を検討した。腎炎の初期段階においてMPOの易放出性を認め、活性化状態であることを示した。
5)真菌由来多糖(CAWS)による自己抗体の産生誘導機構の解析
C. albicansの培養上清からmannoprotein-β-glucan複合体のCAWSを得、マウスに接種し、冠状動脈血管炎の発症と発症機序を解析した。また、抗MPO抗体をin vitro培養系にて効果を評価した。CAWS 、C3Hマウスにおいて全例発症し、培養細胞に対する直接障害作用、サイトカイン産生抑制作用,血小板凝集促進作用、血管内皮細胞機能を示した。CAWSの冠状動脈血管炎誘発活性の特徴を明確にすると共に、抗MPO抗体の活性修飾作用を検討した。
2.抗体作製班
1)MPO-ANCA自己免疫疾患治療に有効な抗体作製に関する研究
ヒトMPOを免疫した正常マウスとマウスMPOを免疫したMPOノックアウトマウスの脾臓B細胞から、それそれ1種類と32種類の抗MPOモノクローナル抗体を作製した。2種類の抗体の性質を解析し、両抗体ともに未変性のMPOと反応し、競合ELISAにより、両抗体の認識するエピトープが異なっていた。本知見は、MPO-ANCA自己免疫疾患モデルマウスに対する抗MPO抗体の治療効果の評価に有用と思われる。
2)MPOの立体構造に関する研究
立体構造上の特徴とMPOフラグメントのリスクの実験結果と比較することにより、MPO上のMPO-ANCAとの分子間相互作用部位を特定した。MPOのMPO-ANCA結合部位はMPOの活性部位周辺の溶媒に露出したループおよびαヘリックスであることが予測された。
結論
1)高齢者に多い難治性自己免疫疾患・血管炎の治療に、ステロイドのリスク軽減になるガンマグロブリン製剤治療がヨーロッパではじまり好成績を得ている。昨年度までに、本研究では、すでにFvおよびFullガンマグロブリン作製の系を確立している。
2)MPO-ANCA関連血管炎へのガンマグロブリン治療を評価した。
3) CADS誘導の血管炎モデルマウスにおけるガンマグロブリン治療を予備的に検討した。
4)上記モデルマウスを利用して血管炎誘発機序を免疫学的に解析した。
5)新たな自然発症の血管炎モデルマウスを検討した。
6)MPOノックアウトマウスを利用してマウスMPO特異的モノクロナール抗体(マウスMPO-ANCA)を得た。
7)MPO立体構造を解析した。
2)MPO-ANCA関連血管炎へのガンマグロブリン治療を評価した。
3) CADS誘導の血管炎モデルマウスにおけるガンマグロブリン治療を予備的に検討した。
4)上記モデルマウスを利用して血管炎誘発機序を免疫学的に解析した。
5)新たな自然発症の血管炎モデルマウスを検討した。
6)MPOノックアウトマウスを利用してマウスMPO特異的モノクロナール抗体(マウスMPO-ANCA)を得た。
7)MPO立体構造を解析した。
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