文献情報
文献番号
200100676A
報告書区分
総括
研究課題名
各種疾患の治療に役立つヒト抗体の単離調製 (総括研究報告書)
課題番号
-
研究年度
平成13(2001)年度
研究代表者(所属機関)
黒澤 良和(藤田保健衛生大学総合医科学研究所)
研究分担者(所属機関)
- 高橋元秀(国立感染症研究所)
- 千葉 丈(東京理科大学)
- 奥野良信(大阪府立公衆衛生研究所)
- 白木公康(富山医科薬科大学)
- 野崎真敏(沖縄衛生研究所)
研究区分
厚生科学研究費補助金 先端的厚生科学研究分野 高度先端医療研究事業（人工血液開発研究分野）
研究開始年度
平成12(2000)年度
研究終了予定年度
平成14(2002)年度
研究費
60,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
治療薬としてヒト抗体が存在すれば役立つことが期待される疾患を対象にヒト抗体を単離調製する。従来は様々な抗原に対して自由にヒト型の抗体を得る方法は存在しなかった。しかし、ファージディスプレー法及びヒト抗体を産生するトランスジェニックマウスの作製によりヒト抗体を単離することが可能になった。今後、治療薬としてヒト抗体が使われる対象疾患は飛躍的に増大することが予想されるが、本研究では、抗原調製が可能であること、抗原結合能がある多数の抗体の中から中和活性等の治療薬としての活性を測定して選択する方法が確立していること、更に治療薬としてのヒト抗体が使用され、治療効果が確実に期待できる疾患を対象とした。具体的には、病原菌の分泌する毒素(ジフテリア毒素、破傷風毒素、百日咳毒素、ベロ毒素、ボツリヌス毒素)、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)、サイトメガロウイルス、麻疹ウイルス、インフルエンザウイルス、B型肝炎ウイルス(HBV)、それにハブ毒素である。それぞれの対象ごとに数種の中和抗体を単離し、それを完全なIgGヒト抗体をコードする遺伝子に変換して動物細胞に導入した後、抗体分泌細胞を得てヒト抗体を産生―精製する。その中和活性を正確に測定するまでを本プロジェクトの達成目標とする。
研究方法
本研究は高橋グループ(各種毒素)、千葉グループ(B型肝炎ウイルス)、白木グループ(水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス)、奥野グループ(インフルエンザウイルス)、野崎グループ(ハブ毒)が抗原の調製、抗体の中和活性の測定を担当し、抗体ライブラリーのスクリーニング、ヒト抗体への変換と発現―調製を黒澤グループが担当するという分業協力体制で実施する。研究を進める中で、抗体単離のマスターソースとして使用した抗体ライブラリー(AIMS)が抗原の性質によって得られる抗体の性能が大きく二つに分かれることが明確になってきた。インフルエンザ(及びロタウイルス)等、AIMSライブラリー作製の材料として用いた数10名のBリンパ細胞供与者が、明らかに頻繁にそのウイルス感染を受けている疾患で、AIMSライブラリーが優れた性質の抗体ソースとして機能した。ジフテリア毒素や破傷風毒素、及びVZVに対する中和抗体については、中和活性を示す抗体が得られるが、作製したIgG型ヒト抗体の相対的に中和活性が弱く、そのまま治療薬として試用可能か、使い方の工夫をすれば役立つか、抗原に対する結合力を高める操作を加える必要があるかを検討する。HBV及びハブ毒については、それぞれ過去の免疫学経歴から中和抗体を保有している人がいる。その人達からBリンパ細胞の供与を受けて、ファージディスプレー系で抗体ライブラリーを作製して、目的とした性質を示す抗体をクローン化する。
結果と考察
一連の研究でin vivoでの抗体レパートリーの性質及びライブラリーの性質が明瞭になってきた。抗体はBリンパ球分化過程でH鎖に於けるVHDJH、L鎖に於けるVLJLというDNA再編成が起こることにより、活性型抗体遺伝子が作られる。個々のB細胞は1組のHL鎖を発現するので1種類の抗体であるが、DNA再編成はB細胞毎に独立に起こるので、B細胞全体では巨大なレパートリーを作る。これは抗原の侵入と無関係に起こる現象でありナイーブレパートリーと呼ばれる。病原菌やウイルスが侵入するとそれを構成する分子と結合できる抗体を産生する細胞は増殖刺激を受けると共に抗体遺伝子座に変異が導入され、抗原結合能を増加させた抗体を産生する細胞が選別され、抗体の成
熟が起こる。以上のようにin vivo中の抗体は抗原の種類によって大きく二つに大別できる。AIMSライブラリーはこのin vivo抗体産生細胞群中で発現されているmRNAを基に作製したが、H鎖及びL鎖を個別にライブラリー化した後、ランダムに組み合わせて莫大な数の抗体ライブラリーとする。そこで、できあがった抗体ライブラリーの中に含まれる構成としては本来のHL鎖の組み合わせとしてin vivoで存在した抗体はごく一部であり、大部分はin vivoとは独立して新しく組み合わさってできたものである。そこで、上記のin vivo抗体レパートリーの二重性がライブラリー中にどのように反映されているか、はっきりしていなかった。しかし示された結果は、AIMSライブラリーはin vivo抗体レパートリーを極めて忠実に反映している。それは、二つの原因による。(1)抗体の抗原特異性はH鎖の方がより大きく貢献し、そして多様性の度合いもH鎖が極端に大きい。(2)抗原特異性に関してL鎖の貢献も重要だが、その多様性の度合いは限られている。AIMSライブラリー作製に際して、この状況は予測していた。得られた結果のポジティブな側面は、(1)ファージディスプレー系を用いて構築される抗体ライブラリーは極めて忠実にin vivo抗体レパートリーを反映した性質を持つこと、(2)その結果、抗血清中にポリクローン抗体の形で存在する様々な抗体をモノクローン化できることが判明したことである。具体的には、インフルエンザ抗体の例でin vivoの抗体に相当する抗原特異性、抗原結合力を示し、更に強い中和活力のある抗体が次々と得られている。Fab型抗体は中和活性を示すが、IgG型に変換するとその活性が失われる問題点のあった抗VZV抗体も分子の安定性が主要な問題であることがはっきりしてきた。抗破傷風毒素抗体についてはエピトープの異なる2種の抗体を混ぜて用いることにより、完全な中和活性が得られた。本研究でHBV及びハブ毒に関して掲げている方針は今後極めて重要になる。HBVの場合は手術で除去された脾臓を用いている(これは特殊な例である)。ハブ毒の場合は、成分採血(リンパ球画分)を行った。これが目的とする抗体を産生している細胞分画ということになれば一般性の高い方法となり得る。つまり、特定の抗原に対して強い中和活性(攻撃力)を持つ抗体を持った人がいれば、その抗体を必ずモノクローン化できる技術を入手したことになる。
本研究プロジェクトも、一部については次の段階(臨床応用)に達しつつある。単離したクローンでIgG1型ヒト抗体が強い中和活性を示す例については、今後どのようなプロセスで臨床薬とするかを考える必要がある。これについては既存特許との関係がある。もう一つはインフルエンザウイルス中和抗体の例であるが、その使用でエスケープミュータントをとることに成功しており、次世代ワクチンとも呼ぶべきワクチン作製法の開発も開始した。
熟が起こる。以上のようにin vivo中の抗体は抗原の種類によって大きく二つに大別できる。AIMSライブラリーはこのin vivo抗体産生細胞群中で発現されているmRNAを基に作製したが、H鎖及びL鎖を個別にライブラリー化した後、ランダムに組み合わせて莫大な数の抗体ライブラリーとする。そこで、できあがった抗体ライブラリーの中に含まれる構成としては本来のHL鎖の組み合わせとしてin vivoで存在した抗体はごく一部であり、大部分はin vivoとは独立して新しく組み合わさってできたものである。そこで、上記のin vivo抗体レパートリーの二重性がライブラリー中にどのように反映されているか、はっきりしていなかった。しかし示された結果は、AIMSライブラリーはin vivo抗体レパートリーを極めて忠実に反映している。それは、二つの原因による。(1)抗体の抗原特異性はH鎖の方がより大きく貢献し、そして多様性の度合いもH鎖が極端に大きい。(2)抗原特異性に関してL鎖の貢献も重要だが、その多様性の度合いは限られている。AIMSライブラリー作製に際して、この状況は予測していた。得られた結果のポジティブな側面は、(1)ファージディスプレー系を用いて構築される抗体ライブラリーは極めて忠実にin vivo抗体レパートリーを反映した性質を持つこと、(2)その結果、抗血清中にポリクローン抗体の形で存在する様々な抗体をモノクローン化できることが判明したことである。具体的には、インフルエンザ抗体の例でin vivoの抗体に相当する抗原特異性、抗原結合力を示し、更に強い中和活力のある抗体が次々と得られている。Fab型抗体は中和活性を示すが、IgG型に変換するとその活性が失われる問題点のあった抗VZV抗体も分子の安定性が主要な問題であることがはっきりしてきた。抗破傷風毒素抗体についてはエピトープの異なる2種の抗体を混ぜて用いることにより、完全な中和活性が得られた。本研究でHBV及びハブ毒に関して掲げている方針は今後極めて重要になる。HBVの場合は手術で除去された脾臓を用いている(これは特殊な例である)。ハブ毒の場合は、成分採血(リンパ球画分)を行った。これが目的とする抗体を産生している細胞分画ということになれば一般性の高い方法となり得る。つまり、特定の抗原に対して強い中和活性(攻撃力)を持つ抗体を持った人がいれば、その抗体を必ずモノクローン化できる技術を入手したことになる。
本研究プロジェクトも、一部については次の段階(臨床応用)に達しつつある。単離したクローンでIgG1型ヒト抗体が強い中和活性を示す例については、今後どのようなプロセスで臨床薬とするかを考える必要がある。これについては既存特許との関係がある。もう一つはインフルエンザウイルス中和抗体の例であるが、その使用でエスケープミュータントをとることに成功しており、次世代ワクチンとも呼ぶべきワクチン作製法の開発も開始した。
結論
我々が作製した抗体ライブラリー(AIMS)は、数10名のヒトの血液内に存在した抗体レパートリーを極めて忠実に反映した構成をしている。そこでインフルエンザウイルスやロタウイルス(多くの人が頻繁に感染)に対する強い中和抗体が数多く含まれ、IgG型ヒト抗体として単離調製に成功した。ジフテリア毒素、破傷風毒素、VZVに対する抗体としては、IgG型ヒト抗体とすると中和活性が相対的に低い。この治療薬としての使用法については、抗体の性能増強も含めて検討を必要とする。HBVやハブ毒に対して、中和抗体を有する人をB細胞供与者としてクローン化を進めている。抗体を有した特定の人がいるわけではないが、治療薬としてヒト抗体である必要がある、例えば、癌抗原に対する治療用抗体のソースとしてもAIMSライブラリーは有用である。以上のように抗体ライブラリーの使用法が具体的に明確になった。
公開日・更新日
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