文献情報
文献番号
200100664A
報告書区分
総括
研究課題名
心疾患及びがん疾患遺伝子のSNPs解析とECAチップによる遺伝子診断システムの確立
課題番号
-
研究年度
平成13(2001)年度
研究代表者(所属機関)
池田 康行(国立循環器病センター研究所)
研究分担者(所属機関)
- 落合 淳志(国立がんセンター研究所支所)
- 竹永 啓三(千葉県がんセンター研究局)
- 赤木 究(埼玉県立がんセンタ-研究所)
研究区分
厚生科学研究費補助金 先端的厚生科学研究分野 高度先端医療研究事業（治療機器等開発研究分野）
研究開始年度
平成13(2001)年度
研究終了予定年度
平成15(2003)年度
研究費
10,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
本研究は、新しい電気化学的活性を持つDNA二本鎖特異的縫い込み型インタ-カレ-タ-(Ferrocenyl Naphthalene Diimide; FND)を用いるECA(Electrochemical Array)チップを完成させるのに必須のソフトウエア、つまり診断にどのような遺伝子を候補とするかを、心疾患およびがん関連遺伝子群から選択し、選択した遺伝子の変異の同定または遺伝子発現を定量できる条件を決定し、ECAチップの実用化を目指すことである。心疾患関連遺伝子の場合、多種のLPL遺伝子変異を同時に検出できる測定条件の決定を目的とする。がん関連の場合は、CEA、K-ras等既知の遺伝子および新たに発見したがん関連遺伝子を用いて、がんの早期診断、転移の有無および治療効果の判定を可能にするECAチップの開発を目指すものである。
研究方法
心疾患関連遺伝子と解析方法: (1)心疾患関連遺伝子:動脈硬化惹起性高トリグリセリド血症の病因遺伝子であるLPL遺伝子を対象とする。エキソン5のG188E変異(188番目のGlyがGluに置換、818G-正常アレル、818A-変異アレル)とエキソン5の916Gの1塩基Gが欠失した変異(916G-正常アレル、916G-del-変異アレル)を解析する。両変異共、LPL酵素機能を完全に失活させるLPL変異である。対象者から得たDNAを鋳型として、エキソン5をPCR増幅(増幅DNAサイズは350bp)し、検体として使用する。(2)ハイブリダイゼイションと電流測定:13から15塩基程度の818G-正常プローブ、818A-変異プロ-ブ、916G-正常プローブおよび916G-del-変異プローブをそれぞれ単電極ECAチップに結合させる。適当な条件下で、プロ-ブを結合した単電極ECAチップとLPL遺伝子エキソン5のPCR 産物とハイブリ後、インタ-カレ-タ-(FND)を含む緩衝液中で電流測定を行なう。
がん関連遺伝子候補選定のための基礎実験:(1)ヒト乳がん細胞株、MCF7、BT549、MDA-MB-231およびOWBMを用いて、がんの浸潤能を検討した。発現を検討する対象遺伝子としては、ER_、EGFR、c-erbB-2、 E-cadherin、S100A4、vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A)、VEGF-Cおよびmatrix metalloprotease-9 (MMP-9)を選択した。
(2)ヒト膵がん培養細胞株Aspc-1, BxPC-3, Capan-1, Miapaca-2, PSN1, Suit-2の6種類ならびに21名(男性18名、女性3名)の健常人末梢血、さらに乳がん患者20例の手術時採取されたリンパ節31個の切片からRNAを抽出し、その発現レベルを調べた。
(3)消化器の進行がん患者の血漿中に存在する癌由来変異K-ras遺伝子のDNA量をPCR-SSCP法で解析し、その推移と治療の効果について検討し、一定の因果関係を見いだした。
がん関連遺伝子候補選定のための基礎実験:(1)ヒト乳がん細胞株、MCF7、BT549、MDA-MB-231およびOWBMを用いて、がんの浸潤能を検討した。発現を検討する対象遺伝子としては、ER_、EGFR、c-erbB-2、 E-cadherin、S100A4、vascular endothelial growth factor-A (VEGF-A)、VEGF-Cおよびmatrix metalloprotease-9 (MMP-9)を選択した。
(2)ヒト膵がん培養細胞株Aspc-1, BxPC-3, Capan-1, Miapaca-2, PSN1, Suit-2の6種類ならびに21名(男性18名、女性3名)の健常人末梢血、さらに乳がん患者20例の手術時採取されたリンパ節31個の切片からRNAを抽出し、その発現レベルを調べた。
(3)消化器の進行がん患者の血漿中に存在する癌由来変異K-ras遺伝子のDNA量をPCR-SSCP法で解析し、その推移と治療の効果について検討し、一定の因果関係を見いだした。
結果と考察
心疾患遺伝子の単電極ECAチップによる遺伝子診断システムの確立(池田):動脈硬化惹起性高トリグリセリド血症の病因遺伝子であるLPL遺伝子変異15種類の内、G188Eと916Gの1塩基欠失の変異を単電極ECAチップを用いて検出する条件設定を試みた。818G-正常ホモ、818G-正常/818A-変異ヘテロおよび818A-変異ホモ接合体は、0.25xSSC緩衝液中で25度、1時間正常および変異プロ-ブとハイブリ後、0.05mMのFNDを含む40度の酢酸緩衝液中での測定で、区別することができた。916G-正常ホモ、916G-正常/916G-del-変異ヘテロおよび916G-del-変異ホモ接合体は、0.25xSSC緩衝液中で25度、1時間正常および変異プロ-ブとハイブリ後、0.05mMのFNDを含む40度の酢酸緩衝液中での測定で、区別することができた。LPL遺伝子ヘテロ接合体検出に関して、プローブDNAがサンプルと2本鎖を形成するかどうかは、パーフェクトマッチなら2本鎖を維持できるものの、ミスマッチを含んでいれば2本鎖を維持できないという条件を選ぶことで対応した。つまり、正常型プローブから応答があればそのサンプルは正常配列を含んでいて、変異型プローブから応答があれば変異配列を含んでいるという結論に到達する。もちろん両方のプローブから電気的応答が得られれば、そのサンプルはヘテロ型となる。ヘテロ型を鑑別診断できる技術は本研究の特徴のひとつと言える。単電極ECAチップでの2種類のLPL変異の検出条件を基にすることで、残り13種類のLPL変異の検出条件の設定が容易になり、将来の多電極(25ピン)ECAチップによるLPL変異診断システムの確立を可能にするものと思われる。
(1) ECAチップによる遺伝子診断システムの確立に必要ながん疾患遺伝子の選択(竹永、落合、赤木): 乳がん細胞株、MCF7、BT549およびMDA-MB-231を用いて浸潤能を検討したところ、MCF7、BT549、MDA-MB-231の順に浸潤能が高いことが判った。そこで、これらの細胞における転移関連遺伝子E-cadherin、S100A4、VEGF-A、VEGF-CおよびMMP-9の発現を検討したところ、浸潤能の亢進に伴ってE-cadherinの発現低下と他の遺伝子の発現亢進を認めたので、これらの遺伝子をECAチップへの候補遺伝子とした。ヒト膵がん培養細胞株Aspc-1, BxPC-3, Capan-1, Miapaca-2, PSN1, Suit-2の6種類の培養細胞あたりにおける候補遺伝子の発現コピー数の検出と実際のヒト組織ならびに血液内における候補遺伝子の発現コピー数を定量PCR法を用いて検討した。がん遺伝子としてCK19、CEA, HER2, Muc1等が比較的高率にがん細胞においてコピー数が多く認められたのでECAチップ作成における候補遺伝子として選択した。血漿中に存在するがん細胞由来のDNAを測定し、これをバイオマーカーとした新しい診断法の開発として、K-rasの遺伝子変異を選択した。K-rasの変異は、ほとんどコドン12であり、この部位を含む領域を蛍光プライマーを用いてPCRで増幅し、SSCPで変異を分離する条件を検討した。その結果、25度でコドン12のすべての変異を分離することができた。また、この解析では、野生型と変異型の比率を求めるが、既知の変異k-ras遺伝子を含むプラスミドを用いて、様々なDNA濃度で測定を行い、検量線を引いて検討した。その結果、この測定系がある程度直線性を持ち、1対20のレベルまではその比をほぼ正確に測定できることがわかった。乳がん細胞株としてMCF7、BT549およびMDA-MB-231は、浸潤能に伴って異なるレベルで本研究で選択したがん遺伝子を発現していることから、遺伝子発現解析のときの標準細胞株として用いることが可能と思われた。
(2) 乳がんの微小リンパ節転移を予測するために、がんマーカーならびに上皮細胞マーカーをの選択を行った結果、CK19, CEA, Muc1そしてHER2はがんの微小リンパ節転移の定量化に向いている分子マーカーであることが明かとなった。
(3)血漿DNAをアクリルアミドゲルで泳動すると、約180bp, 340~60bp近傍にDNA断片が主に存在し、このことから血漿DNAはヌクレオソーム単位で存在することが示唆された。このために、血漿DNAは血中ですくに分解されず、循環するものと思われた。血漿DNA量は、がん細胞の増殖と縮小に相関して変動する傾向を認め、新しいマーカーとして利用できる可能性が見い出された。
(1) ECAチップによる遺伝子診断システムの確立に必要ながん疾患遺伝子の選択(竹永、落合、赤木): 乳がん細胞株、MCF7、BT549およびMDA-MB-231を用いて浸潤能を検討したところ、MCF7、BT549、MDA-MB-231の順に浸潤能が高いことが判った。そこで、これらの細胞における転移関連遺伝子E-cadherin、S100A4、VEGF-A、VEGF-CおよびMMP-9の発現を検討したところ、浸潤能の亢進に伴ってE-cadherinの発現低下と他の遺伝子の発現亢進を認めたので、これらの遺伝子をECAチップへの候補遺伝子とした。ヒト膵がん培養細胞株Aspc-1, BxPC-3, Capan-1, Miapaca-2, PSN1, Suit-2の6種類の培養細胞あたりにおける候補遺伝子の発現コピー数の検出と実際のヒト組織ならびに血液内における候補遺伝子の発現コピー数を定量PCR法を用いて検討した。がん遺伝子としてCK19、CEA, HER2, Muc1等が比較的高率にがん細胞においてコピー数が多く認められたのでECAチップ作成における候補遺伝子として選択した。血漿中に存在するがん細胞由来のDNAを測定し、これをバイオマーカーとした新しい診断法の開発として、K-rasの遺伝子変異を選択した。K-rasの変異は、ほとんどコドン12であり、この部位を含む領域を蛍光プライマーを用いてPCRで増幅し、SSCPで変異を分離する条件を検討した。その結果、25度でコドン12のすべての変異を分離することができた。また、この解析では、野生型と変異型の比率を求めるが、既知の変異k-ras遺伝子を含むプラスミドを用いて、様々なDNA濃度で測定を行い、検量線を引いて検討した。その結果、この測定系がある程度直線性を持ち、1対20のレベルまではその比をほぼ正確に測定できることがわかった。乳がん細胞株としてMCF7、BT549およびMDA-MB-231は、浸潤能に伴って異なるレベルで本研究で選択したがん遺伝子を発現していることから、遺伝子発現解析のときの標準細胞株として用いることが可能と思われた。
(2) 乳がんの微小リンパ節転移を予測するために、がんマーカーならびに上皮細胞マーカーをの選択を行った結果、CK19, CEA, Muc1そしてHER2はがんの微小リンパ節転移の定量化に向いている分子マーカーであることが明かとなった。
(3)血漿DNAをアクリルアミドゲルで泳動すると、約180bp, 340~60bp近傍にDNA断片が主に存在し、このことから血漿DNAはヌクレオソーム単位で存在することが示唆された。このために、血漿DNAは血中ですくに分解されず、循環するものと思われた。血漿DNA量は、がん細胞の増殖と縮小に相関して変動する傾向を認め、新しいマーカーとして利用できる可能性が見い出された。
結論
心疾患関連:単電極ECAチップを用いて、2種類のLPL遺伝子変異(G188Eと916Gの1塩基欠失)の変異LPL/変異LPLのホモ接合型、正常LPL/変異LPLのヘテロ接合型および正常LPL/正常LPLのホモ接合体の検出が可能となった。
がん関連:ヒト乳がんの浸潤・転移の予測のマ-カ-として、E-cadherin、S100A4、VEGF-A、VEGF-C、matrix metalloprotease-9、また、CK19, CEA, Muc1, HER2などの遺伝子の発現を感度よく測定することによりリンパ節の転移の有無を測定することが可能になると考えられた。がん患者における血漿DNAは、がんの治療効果や再発を知るのに、有効なマーカーであることが示唆された。
がん関連:ヒト乳がんの浸潤・転移の予測のマ-カ-として、E-cadherin、S100A4、VEGF-A、VEGF-C、matrix metalloprotease-9、また、CK19, CEA, Muc1, HER2などの遺伝子の発現を感度よく測定することによりリンパ節の転移の有無を測定することが可能になると考えられた。がん患者における血漿DNAは、がんの治療効果や再発を知るのに、有効なマーカーであることが示唆された。
公開日・更新日
公開日
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更新日
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