文献情報
文献番号
200100649A
報告書区分
総括
研究課題名
ライソゾーム性筋疾患の病態究明と治療法開発に関する研究
課題番号
-
研究年度
平成13(2001)年度
研究代表者(所属機関)
西野 一三(国立精神・神経センター神経研究所)
研究分担者(所属機関)
- 埜中征哉(国立精神・神経センター武蔵病院)
- 石浦章一(東京大学大学学院)
- 田中嘉孝(九州大学大学院)
- 辻野精一(国立精神・神経センター神経研究所)
研究区分
厚生科学研究費補助金 先端的厚生科学研究分野 脳科学研究事業
研究開始年度
平成13(2001)年度
研究終了予定年度
平成15(2003)年度
研究費
30,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
ライソゾーム性筋疾患の研究は立ち遅れており、「ライソゾーム性筋疾患」という言葉に対する定義すら定まっていない。我々は、ライソゾーム性筋疾患を、自己貪食空胞性ミオパチー(autophagic vacuolar myopathy; AVM)と縁取り空胞性ミオパチー(rimmed vacuolar myopathy; RVM)とに分類する。RVMは、幾つかの疾患で原因遺伝子が明らかになっているが、全てライソゾームとは直接関係のない蛋白であり、二次的ライソゾーム性筋疾患と思われる。これに対し、AVMは一次的ライソゾーム性筋疾患である可能性が高い。最近我々は、AVMの1つであるDanon病が、ライソゾーム膜蛋白lysosome-associated membrane protein-2 (LAMP-2)の原発性欠損により生じることが明らかにした。しかし、依然として疾患概念に混乱がある。そこで、遺伝学的にDanon病と確定した患者を集めその臨床像につき、再検討を行った。また、Danon病と同じ疾患名で報告されている2例の乳児例がDanon病と遺伝学的に同じ疾患であるかどうかを検討した。さらに、AVMの治療開発の一環として、AMDモデルマウスに対するAAVベクターの遺伝子導入の効果について検討した。RVMについては、DMRV患者においてGNE遺伝子変異の有無を検討した。これは、臨床症状が酷似し同部位に遺伝子座が存在するHIBMが最近UDP-N-acetylglucosamine 2-epimerase/N-acetylmannosamine kinaseをコードする遺伝子(GNE)の変異と関連していることが報告されたためである。これらの研究を通して、ライソゾーム性筋疾患共通の病態を探り、治療法開発の手掛かりを得たい。
研究方法
1.Danon病の臨床病理学的研究について:遺伝学的にDanon病が確定している13家系38名(男20名、女18名)を対象とし、臨床病理学的検討を行った。2.乳児型AVMに関する研究について:これまでに報告されている乳児型2例の骨格筋に対して、免疫染色および電顕的検討を行った。また、LAMP-2遺伝子オープンリーディングフレームのシークエンスを決定した。3.異なる血清型のAAVベクターによるAV遺伝子導入の検討について:ヒト培養線維芽細胞およびAM欠損マウスの線維芽細胞と個体に対して3種の血清型のAM発現またはLacZ発現AAVベクター(AAV2, AAV3, AAV5)で遺伝し導入した後、染色および酵素活性測定を行った。4.DMRVの原因遺伝子に関する研究について:互いに血縁関係がなく、臨床および病理学的にDMRVと診断された24名の日本人患者を対象とし、GNE遺伝子の全エクソンおよびエクソン・イントロン境界領域の塩基配列を決定した。
結果と考察
1.Danon病の臨床病理学的研究について:男性患者では、全例で心筋症とミオパチーが認められたが、精神遅滞は70%の頻度であった。女性患者では、心筋症は全例に認められたが、ミオパチーは33%、精神遅滞は6%であった。また、血清CK値は男性患者では全例で上昇が見られたが、女性患者では63%に上昇が見られるのみであった。死亡年齢は男性が19±6歳、女性が40±7歳で何れも死因は心不全であった。また、肝腫大を男性例の36%に認めた。従って、LAMP-2欠損は心筋・骨格筋・脳だけでなく、他の臓器にも何らかの影響を及ぼしていることを示唆している。組織学的には、全例でLAMP-2が欠損していた。筋線維内の空胞はその膜上にアセチルコリンエステラーゼ活性を有し、また、筋鞘膜蛋白が存在していた。このことは、空胞が筋鞘膜の嵌入に由来することを示唆している。これまで、Danon病女性患者に関する検討は全くなかったが、今回の検討から、男性患者に比べて臨床症状は比較的軽度ではあるものの、全
例で致死的心筋症を来すことが明らかとなった。加えて、男性患者とは異なり、ミオパチーを伴わない例があり、女性例では血清CK値の上昇を伴っていなくともDanon病を否定できないことが明らかとなった。2.乳児型AVMに関する研究について:両例ともに骨格筋の免疫染色でLAMP-2は欠損しておらず、また、LAMP-2遺伝子変異も見いだされなかった。従って、乳児型はDanon病とは異なる疾患であり、乳児型AVMと呼ばれるべきである。組織学的には、補体C5b-9が筋線維表面に沈着していた。電顕的観察では、筋線維内の自己貪食空胞を多数認めると共に、基底膜が重層化しその層間にexocytosisを受けた後と思われる自己貪食産物が多数認められた。これらの形態学的所見は、Danon病よりはむしろ過剰自己貪食を伴うX連鎖性ミオパチー(XMEA)で見られる所見であり、乳児型AVMはXMEAに近い病態を持つことが示唆された。3.異なる血清型のAAVベクターによるAV遺伝子導入の検討について:ヒト培養線維芽細胞では、3種のAAV-AMはほぼ同様にAM活性を発現したが、AM欠損マウスの線維芽細胞と個体に対しては、AAV-5の効率が著明に高かった。従って、AM欠損マウスに対して従来用いられてきたAAV2よりも、AAV5で遺伝子導入発現効率が格段に良いことが明らかであり、AAV5-AMを用いた治療実験が期待される。4.DMRVの原因遺伝子に関する研究:24名の内18名にホモ接合型または複合へテロ接合型のGNE遺伝子変異を認めた。見出された変異は7種類で、epimeraseドメインに変異のあるものが4種類、kinaseドメインに変異のあるものが3種類であった。Epimeraseドメインの変異とkinaseドメインの変異の複合へテロ型変異は、5例に認められた。何れの変異もHIBMにおいて報告されているものとは異なっていた。HIBMにおいて報告されている変異とは異なってはいるが、臨床的にDMRVがHIBMに酷似していることに加えてDMRV患者においてもGNE遺伝子変異が見出されたことは、DMRVとHIBMがallelic diseaseであることを強く示唆している。また、epimeraseドメインの変異とkinaseドメインの変異の複合へテロ型変異が認められる例があったことは、恐らく、一方のドメインの異常があれば2つの酵素の活性が共に影響を受けることを示唆している。また、GNE遺伝子に変異を認めないDMRV患者の存在については、イントロンなどシークエンスを決定していない部分に変異がある可能性は残るものの、DMRV自体が遺伝学的に不均一である可能性が示唆された。
例で致死的心筋症を来すことが明らかとなった。加えて、男性患者とは異なり、ミオパチーを伴わない例があり、女性例では血清CK値の上昇を伴っていなくともDanon病を否定できないことが明らかとなった。2.乳児型AVMに関する研究について:両例ともに骨格筋の免疫染色でLAMP-2は欠損しておらず、また、LAMP-2遺伝子変異も見いだされなかった。従って、乳児型はDanon病とは異なる疾患であり、乳児型AVMと呼ばれるべきである。組織学的には、補体C5b-9が筋線維表面に沈着していた。電顕的観察では、筋線維内の自己貪食空胞を多数認めると共に、基底膜が重層化しその層間にexocytosisを受けた後と思われる自己貪食産物が多数認められた。これらの形態学的所見は、Danon病よりはむしろ過剰自己貪食を伴うX連鎖性ミオパチー(XMEA)で見られる所見であり、乳児型AVMはXMEAに近い病態を持つことが示唆された。3.異なる血清型のAAVベクターによるAV遺伝子導入の検討について:ヒト培養線維芽細胞では、3種のAAV-AMはほぼ同様にAM活性を発現したが、AM欠損マウスの線維芽細胞と個体に対しては、AAV-5の効率が著明に高かった。従って、AM欠損マウスに対して従来用いられてきたAAV2よりも、AAV5で遺伝子導入発現効率が格段に良いことが明らかであり、AAV5-AMを用いた治療実験が期待される。4.DMRVの原因遺伝子に関する研究:24名の内18名にホモ接合型または複合へテロ接合型のGNE遺伝子変異を認めた。見出された変異は7種類で、epimeraseドメインに変異のあるものが4種類、kinaseドメインに変異のあるものが3種類であった。Epimeraseドメインの変異とkinaseドメインの変異の複合へテロ型変異は、5例に認められた。何れの変異もHIBMにおいて報告されているものとは異なっていた。HIBMにおいて報告されている変異とは異なってはいるが、臨床的にDMRVがHIBMに酷似していることに加えてDMRV患者においてもGNE遺伝子変異が見出されたことは、DMRVとHIBMがallelic diseaseであることを強く示唆している。また、epimeraseドメインの変異とkinaseドメインの変異の複合へテロ型変異が認められる例があったことは、恐らく、一方のドメインの異常があれば2つの酵素の活性が共に影響を受けることを示唆している。また、GNE遺伝子に変異を認めないDMRV患者の存在については、イントロンなどシークエンスを決定していない部分に変異がある可能性は残るものの、DMRV自体が遺伝学的に不均一である可能性が示唆された。
結論
1.Danon病は、男性患者では心筋症・ミオパチー・精神遅滞を3主徴とする疾患であるが、女性患者においては、男性患者よりも症状は軽いものの、全例で致死性の心筋症を来すので注意が必要である。また、多くの場合心筋症のみを発症、CK値の上昇を認めないことがある。2.従来、Danon病と同じ疾患名で報告されていた乳児型自己貪食空胞性ミオパチーはDanon病とは遺伝学的に異なる疾患である。3.AAV5は遺伝導入発現効率が高く、有望である。4.18名のDMRV患者においてGNE遺伝子変異を見出した。少なくとも大半のDMRVは遺伝学的にHIBMと同一である可能性が高い。
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