アルツハイマー病に対する経口投与可能な神経保護薬の開発:ミトコンドリアにおける細胞死シグナルの制御の試み(総括研究報告書)

文献情報

文献番号
200100595A
報告書区分
総括
研究課題名
アルツハイマー病に対する経口投与可能な神経保護薬の開発:ミトコンドリアにおける細胞死シグナルの制御の試み(総括研究報告書)
課題番号
-
研究年度
平成13(2001)年度
研究代表者(所属機関)
丸山　和佳子(国立療養所中部病院 長寿医療研究センター)
研究分担者(所属機関)
  • 辻本　賀英(大阪大学大学院医学系研究科)
  • 直井　信(応用生化学研究所)
  • 錫村明生(名古屋大学環境医学研究所)
  • 赤尾　幸博(財団法人岐阜県国際バイオ研究所)
研究区分
厚生科学研究費補助金 総合的プロジェクト研究分野 21世紀型医療開拓推進研究（痴呆・骨折研究分野）
研究開始年度
平成13(2001)年度
研究終了予定年度
平成15(2003)年度
研究費
20,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-

研究報告書（概要版）

研究目的
B型モノアミン酸化酵素の阻害剤として既に臨床でパーキンソン病に使用されている(-)deprenyl (selegiline) は、細胞実験、あるいは動物実験において神経保護効果を有することが示されている。神経変性疾患に対する保護療法の試みとしてselegilineが未治療パーキンソン病患者に投与され、大規模な患者対照研究が行なわれたが、その神経保護作用は証明されなかった。この原因は、selegiline による神経保護作用の分子生物学的機序が明らかにされないまま、患者への応用がなされたため、使用量設定や、薬効の評価系が不適切であったことが考えられる。本研究ではselegilineおよびその類似化合物であるpropargylamine 化合物の作用機序をin vitro、in vivo の実験で解明する。さらに、作用に必要な化学構造を明らかとすることによって新規でより効果の高い薬剤を開発することを目的とする。薬剤による神経保護療法は遺伝子治療や神経幹細胞移植等他の方法と比較して簡便性、安全性、経済性において優れている。selegilineは経口投与可能で脳内移行が良好な化合物であり、また、重篤な副作用も現在までのところ報告されていない。従って臨床応用可能な神経保護薬が類似化合物から見い出される可能性は極めて高いと考えられる。世界初の経口投与可能な神経保護薬を開発し、高齢化社会に貢献したい。
研究方法
初年度は主に培養細胞等を用いたin vitro の系でpropargylamine 化合物の作用機序を解明した。予備実験でpropargylamine 化合物の中でも最も神経保護活性が高かったN-propargylamine-1(R)-aminoindane (rasagiline) を中心に研究を行なった。ヒト神経芽細胞腫であるSH-SY5Y細胞にrasagilineを投与し、神経栄養因子であるGDNF、BCL-2 ファミリーのmRNAおよびタンパク量の変化を検討した。転写因子であるNFκBの活性化を検討した。また、ラットに rasagiline の持続皮下注を行ない、抗酸化酵素である脳内superoxide dismutase (SOD) およびcatalase活性を測定した。(丸山)老化に伴なう神経変性疾患においてはミトコンドリア依存性のアポトーシスシグナル活性化の関与が示唆されている。このシグナル伝達を制御する中心的機構としてミトコンドリアにおけるpermeability transition pore (PT pore) に注目した。PT poreの重要な構成分子であるvoltage dependent anion channel (VDAC) が哺乳類のアポトーシスの系でPT poreの開孔に関与しているかをin vitroで研究した。また、 BCL-2ファミリーによるPT pore 制御における機能的標的分子について検討を行なった。実験にはVDAC を組み込んだリポソーム、ラット肝臓から調製したミトコンドリア、および抗VDAC抗体を用いた。(辻本)propargylamine 化合物による神経保護タンパクの誘導作用、およびPT pore 制御作用について必要な化学構造を検討した。SH-SY5Y 細胞を用い、ミトコンドリアの膜電位低下を蛍光色素であるJC-1 によって経時的に測定した。酸化ストレスや神経毒によりPT pore 開孔を引き起こした。この系を用い膜電位低下にpropargylamine化合物が及ぼす影響について検討を加えた。(直井)rasagiline のミトコンドリアシグナルに及ぼす作用を分子レベルで解明するために、ラット肝臓より単離したミトコンドリアにrhodamineを予めloadingしておき、PT pore 開孔に及ぼすrasagiline の直接作用をin vitro で検討した。(赤尾)アル
ツハイマー病における細胞死には増加したamyloid βprotein (Aβ) による直接の毒性とミクログリアの活性化を介した毒性が存在することが示唆されている。アルツハイマー病の神経細胞死モデルを開発する目的で、AβのSH-SY5Y 細胞、マウス神経芽細胞腫Neuro2a細胞、あるいはマウスミクログリア初代培養系に与える影響を検討した。(錫村)倫理面への配慮について:動物実験に関しては各々の施設の実験動物委員会および倫理委員会に諮り、動物愛護の精神に基づき実験を行なった。
結果と考察
propargylamine 化合物であるrasagiline は、GDNF およびBCL-2タンパクの増加をSH-SY5Y細胞に、SODと catalaseの活性増加をラット脳に引き起こした。rasagilineによるGDNFの増加はNFκBの活性化抑制剤であるsulfosaladine により阻害された。Rasagiline添加後1時間でNFκBの活性化と核内移行が観察された。(丸山)哺乳類のPT pore 制御においてもVDACが必須であり、BCL-2ファミリーの標的分子はVDACであることが明らかとされた。(辻本)SH-SY5Y細胞に酸化ストレスや神経毒を負荷することによりPT pore 開孔が引き起こされるとともに膜電位は低下した。propargylamine 化合物によりこの低下は抑制された。膜電位低下抑制作用にはpropargylamine基とともに適当な長さの疎水基が必要であった。(直井)ラット肝臓より単離したミトコンドリアに対して神経毒はPT pore を開孔させ、rasagiline はこれを用量依存的に阻害した。(赤尾)AβはSH-SY5Y細胞およびNeuro2a 細胞に対して形態変化と細胞死を惹起した。マウスミクログリア細胞にはTNF とNO synthase (NOS) を誘導した。(錫村)本研究班の今年度の研究成果によりrasagiline などのpropargylamine 化合物には、1) ミトコンドリアに存在するpermeability transition pore を直接制御する作用　と　2) 神経保護に働く複数のタンパク発現を誘導することによって細胞死を防御する作用の2つが存在することが証明された。今後、Aβを用いたアルツハイマー病細胞死モデルや動物モデルを用いてpropargylamine 化合物の神経保護効果を検討するとともに、より強力な神経保護薬の開発を目指すことが必要である。
結論
propargylamine 化合物はミトコンドリアPT poreを制御する直接(短期)作用と、神経保護作用をもつタンパクの発現誘導を引き起こす間接(長期)作用によって神経保護に働くことが示された。Aβの細胞毒性にはミトコンドリアPTが関与している可能性が示唆された。propargylamine 化合物は経口投与可能な神経保護薬として有望である。今後、本薬剤の作用機序の解明と臨床応用、新薬開発に向けて研究を発展させる。

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