幹細胞からの膵β細胞分化誘導に関する研究(総括研究報告書)

文献情報

• 文献番号: 200100469A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: 幹細胞からの膵β細胞分化誘導に関する研究(総括研究報告書)
• 課題番号: -
• 研究年度: 平成13(2001)年度
• 研究代表者(所属機関): 清野 裕(京都大学)

研究分担者(所属機関)

• 山田祐一郎(京都大学)
• 武田純(群馬大学)
• 安波洋一(福岡大学)

• 研究区分: 厚生科学研究費補助金 総合的プロジェクト研究分野 ヒトゲノム・再生医療等研究事業（再生医療研究分野）
• 研究開始年度: 平成13(2001)年度
• 研究終了予定年度: 平成15(2003)年度
• 研究費: 30,000,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

糖尿病は過去40年間に70倍に激増し、690万に達した。糖尿病に伴って生じる合併症も深刻な問題となっており、糖尿病による透析導入や後天的な失明もそれぞれ年間約12,000人、4,000人と原因の第1位である。糖尿病の治療として、インスリン注射などを用いた厳格な血糖コントロールが行われているが、このような対症療法では血糖の制御を行うことは不可能で、かつ重篤な低血糖の増加やQOLの低下を招くため、根本的な治療法の確立が望まれている。膵島移植は、可能性は秘めているが、免疫抑制薬を継続投与する必要性があること以外に、ヒトでは十分な量の膵島を得ることが困難であること、ブタでは異種間感染の可能性など解決すべき問題が多い。最近の発生工学・細胞生物学の進展により、膵β細胞の分化増殖機構が明らかにされてきた。そこで、これらの知見を応用して、幹細胞から膵β細胞を作製して供用しようとする膵β細胞の再生療法は、糖尿病の根治治療法として期待されている。本研究は、膵β細胞の幹細胞を、in vitroで増殖させ膵β細胞を分化させることを目的としている。

研究方法

神経細胞の幹細胞で発現が報告されているintermediate filamentであるネスチンに着目し、ネスチン遺伝子のプロモータの下流にEGFP(enhanced green fluorescent protein)遺伝子を結合させたトランスジェニックマウス(ネスチンEGFPマウス)から、膵β細胞の幹細胞の単離を試みた。まず、ネスチンEGFPマウスから膵ランゲルハンス島をコラギナーゼ法で単離した。次に、トリプシン処理を行うことにより、個々の細胞に分散させた。分散した細胞を用いてナイロンメッシュを通した後、fluorescence-acitivated cell sorting法(FACS法、Beckman Coulter社、ALTRA)により、EGFP強度が高い分画の細胞を単離した。EGFP陽性の細胞からmRNA purification kit を用いてmRNAを抽出し、SuperscriptⅡを用いて、cDNAを合成した。得られたcDNAをrealtime PCR法(Taqman)を用いて、種々の遺伝子発現量を検索した。EGFP陽性細胞を、ラミニン、ポリリジン、フィブロネクチン、コラーゲンなどでコートした培養ディッシュを用いて、EGFやbFGFの存在下で培養した。DNAマイクロアレイ化し幹細胞に特異的に発現しているマーカーを同定する基盤のため、まずマウスMIN-6細胞やマウス小腸で発現しているmRNAより、cDNAライブラリーを作製し、EST(expression sequence tag)を決定した。さらに、C57BL/6マウスをドナー、レシピエントに用いた。胎生18日目の膵臓を実体顕微鏡下に摘出しストレプトゾトシン(STZ)糖尿病マウスの腎皮膜下に移植した。移植後週3回血糖値(非空腹時)および体重を測定した。移植後経時的にグラフトを免疫組織学的に解析した。

結果と考察

FACSまでの種々の条件を検索することによって、5匹のネスチンEGFPマウスより、約1万から5万個のEGFP陽性細胞を分取することが可能となった。EGFP陽性細胞においては、インスリン遺伝子の発現が低下しているのみならず、膵β細胞の機能維持に必須であることが報告されているPdx-1遺伝子発現も低下していることを明らかにした。 ポリリジンでコートした培養ディッシュを用いることにより、より長期に培養できることを確認した。ESTについては、合計18,479個の配列を得た。約半数が既知遺伝子に由来した。3'クラスタリング解析を行い、効率のよいDNAマイクロアレイ作製の分子資源の準備は順調に進んでいる。また、4匹分の胎児膵組織移植でレシピエントは移植後30日前後で正常血糖となり、この条件下では高血糖を是正できる十分量の膵β細胞が移植後グラフト内に分化増殖したと考えられ
た。移植前グラフトの免疫組織染色でインスリン陽性細胞は通常の膵島としてではなく、ほとんどが小集積(クラスター)として膵内に散在していた。移植後の時間の経過とともにいわゆる膵島を形成していた。

結論

本年度は、膵β細胞の幹細胞を単離することを主たる目的とし研究を遂行した。膵ランゲルハンス島より、ネスチンプロモータによって活性化されるEGFP強度を指標として、単離することが可能となった。単離した幹細胞は、予想されたようにインスリン遺伝子の発現は低かったが、それに加えて膵β細胞の機能維持に重要と考えられる転写因子Pdx-1の発現も低下していた。このことは、in vitroで幹細胞から膵β細胞に増殖分化させるにあたって、Pdx-1をいかに活性化するかが重要であることが示唆された。また、幹細胞特性の検討のため遺伝子解析が適していると考え、膵ランゲルハンス島や小腸cDNAのmicroarray作製の基盤ができた。来年度にはEGFP陽性細胞のcDNAを用いて幹細胞の遺伝子発現特性を解析することが可能となった。また、比較的幹細胞に似た性質を有する胎児膵組織を移植することによって糖尿病治療の予備的検討を進めることができた。
E.結論
ネスチン遺伝子のプロモータにEGFPを結合したトランスジェニックマウスから、膵β細胞の幹細胞の単離に成功した。遺伝子発現の検討や長期培養を行うことにより、幹細胞の特性を検討している。

公開日・更新日

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