文献情報
文献番号
200100460A
報告書区分
総括
研究課題名
新規遺伝子 (Ca-dependent mitochondrial solute carrier) の機能解析と疾患発症の分子機構の解明ならびに遺伝子診断と治療法の開発
課題番号
-
研究年度
平成13(2001)年度
研究代表者(所属機関)
佐伯 武頼(鹿児島大学医学部)
研究分担者(所属機関)
- 小林圭子(鹿児島大学医学部)
- 飯島幹雄(鹿児島大学医学部)
- Stephen W. Scherer(University of Toronto、Canada)
研究区分
厚生科学研究費補助金 総合的プロジェクト研究分野 ヒトゲノム・再生医療等研究事業（ヒトゲノム分野）
研究開始年度
平成11(1999)年度
研究終了予定年度
平成13(2001)年度
研究費
35,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
尿素サイクル酵素argininosuccinate synthetase (ASS) の異常は、シトルリン血症を引き起こす。ASS遺伝子の異常に起因する古典型シトルリン血症 (CTLN1) とは異なり、肝臓特異的ASS蛋白の低下に基づく成人発症II型シトルリン血症 (CTLN2) では、ASS遺伝子に異常は認められず、長年真の原因は不明であった。CTLN2は本邦で発症者数の多い予後不良の難病であり、病因解明は急務であった。我々は、homozygosity mapping、positional cloning、変異解析により、CTLN2の責任遺伝子として新規遺伝子SLC25A13を同定し、Ca-dependent mitochondrial solute carrierに属するその遺伝子産物をcitrinと命名した(Nat Genet 22:159-163, 1999)。本研究の目的は、(1) citrinならびにその類似蛋白であるaralarの機能や生理的役割を解明し、(2) それらの異常により生じる病態を把握し、疾患発症の分子機構を明らかにし、(3) 迅速で確実な診断法を確立し、(4) 有効な治療法の開発を目指し、(5) 疾患の発症予防を可能にし、もって国民の健康管理と医学の向上を図り、社会に貢献することである。
研究方法
機能解析ではリコンビナント蛋白をリポソームに組み込んだミトコンドリア膜再構築系により、各種物質の輸送活性を測定し、培養細胞系に遺伝子を導入し、輸送活性に及ぼすカルシウムの効果を検討した。相互作用する蛋白の検索では、yeast two hybrid systemを用いた。生理的役割を明らかにする目的で、マウスを用いて、発現する組織分布、成長に伴う変化、環境変化効果などにおけるmRNAならびに蛋白レベルを、Northern blotおよびWestern blot解析により検討した。Homologous recombinationにより、citrin蛋白の最初の膜貫通ドメイン領域を欠失したノックアウト (KO) マウスを作成した。また、Lexicon Genetics社との共同で、citrinおよびaralar挿入変異マウスを作成した。国内外の医療機関から依頼を受け、高アンモニア血症診断のために20数年来継続してきた尿素サイクル5つの酵素活性を測定した。CTLN2とCTLN1を確実に鑑別診断するため、SLC25A13遺伝子のみならずASS遺伝子についても解析した。新規変異の同定は、RT-PCRおよびゲノムDNA-PCRで増幅した産物の塩基配列決定により行なった。GeneScan/SNaPshot法を用いたマルチ検出システムによる多検体遺伝子診断法を開発した。遺伝子検索では、文書による同意を得た後、被験者 (患者とその家族あるいは健常者) の主に血液細胞から抽出したDNAを用いた。本研究の遂行に際し、平成12年1月25日に鹿児島大学医学部倫理委員会の承認を受け、それに基づいて個人の人権擁護とインフォームドコンセントの確保を心掛けた倫理的配慮を行なった。
結果と考察
(1) Citrinとaralarの機能と生理的役割:アミノ酸配列で77.8% identityを示す両蛋白は、aspartate glutamate carrier (AGC) 活性を持ち、C-half領域のみでもフル活性を示し、そのAGC活性はカルシウムにより活性化されることを明らかにした。AGCは、尿素合成過程(細胞質局在のASS)にaspartateを供給する一方、malate aspartate shuttleを構成し、NADH(還元当量)をミトコンドリアに運ぶ役割があり、代謝の要にある重要な蛋白である。Citrinは肝臓、腎臓、心臓、また新生児期の小腸に発現するが、aralarは骨格筋、脳、心臓、腎臓に限局していた。Aralarが発現しない肝臓ではcitrinの役割は重要であり、肝臓特異的疾患であるcitrin欠損症において大きな意味を持つ。相互作用する蛋
白として、Protein kinase CのCa調節蛋白や酸化還元関連蛋白を単離している。(2) 疾患モデルマウス:Citrin-KOならびに挿入変異マウスでは、citrin mRNAおよび蛋白が欠損していた。しかし、ヒトの疾患で見られる顕著な症状はまだ表われていない。一方、aralar挿入変異マウスでは外見上のphenotypeに違いが認められるので、まだ知られていないヒト疾患を解明する上で非常に有用なマウスに成り得ると考える。(3) NICCDの発見と代償機構:特発性新生児肝炎患者にSLC25A13変異を見いだし、CTLN2とは異なる新生児期の病態をNICCD (neonatal intrahepatic cholestasis caused by citrin deficiency) と名付けた。これまでCTLN2の新生児期症状の記載は乏しかったので、この発見は重要である。症状は、肝内胆汁うっ滞、黄疸遅延、低蛋白血症、凝固異常、多種アミノ酸血症(シトルリン、メチオニン、チロシン、スレオニンなど)、ガラクトース血症、低血糖、脂肪肝など非常に多彩である。NICCD症状は1歳前後で消失するので、何らかの適応・代償機構(グリセロリン酸shuttleやmalate citrate shuttleなど)が働いていると推察する。見かけ上健康に過ごす期間(10数年～数10年)を経て、代償機構の破綻など現在不明の機構によって、CTLN2の発症に至ると考えている。(4) 変異同定とマルチ診断法の確立:NICCDおよびCTLN2のSLC25A13遺伝子上に、新たに8種の変異(一部多型の可能性)を同定した。高頻度変異2種([I]と[II]で80%)を含めた9種に対して、GeneScan/SNaPshot法を利用したマルチ診断法を確立した。(5) 変異頻度検索:CTLN2症例の240 allele中90%に9種の変異を認め、従来の診断基準が正しかったことが証明でき、一疾患概念の樹立につながった。我々は20数年間に150例(年に6～7例)のCTLN2症例を解析・診断してきたが、発見から2年程度の短期間でNICCDと診断した症例は70例を超え、数の多さに驚いている。一方、健常者1372人の解析では、20人の保因者を認め、SLC25A13変異遺伝子が本邦において高頻度(1/20,000)に存在することを見いだした。以前報告したCTLN2の発症率 (1/100,000) とは大きく異なる。変異ホモ接合体は、① CTLN2発症、② てんかん、精神分裂病、うつ病など他疾患と誤診、③ 健康に過ごすと考えている。(6) Citrin欠損症の世界的な拡がり:日本人症例で見いだした変異が、中国人CTLN2患者ならびにベトナム人NICCD患者で認められた。さらに、パレスチナ人のNICCD症例では新規変異を同定し、患者は広範に存在することが示唆された。(7) Citrin欠損症の治療:NICCD症例では、全くの自然治癒例も認められるが、新生児肝炎の治療に準じて対処されている症例も多い。しかし、乳児期に肝移植を必要とした重症例(分類不能型チロシン血症と診断)も存在するので、必ずしも予後良好とは言い難い。それに対して、CTLN2症状は重篤であり、発症後急激な進行で死に至る場合も多いため、有効な治療法として肝移植がこれまで22例に適用された。肝移植は高額な医療費を必要とし、ドナーの問題もあるので、早急に新しい概念に基づいた治療法を開発する必要がある。
白として、Protein kinase CのCa調節蛋白や酸化還元関連蛋白を単離している。(2) 疾患モデルマウス:Citrin-KOならびに挿入変異マウスでは、citrin mRNAおよび蛋白が欠損していた。しかし、ヒトの疾患で見られる顕著な症状はまだ表われていない。一方、aralar挿入変異マウスでは外見上のphenotypeに違いが認められるので、まだ知られていないヒト疾患を解明する上で非常に有用なマウスに成り得ると考える。(3) NICCDの発見と代償機構:特発性新生児肝炎患者にSLC25A13変異を見いだし、CTLN2とは異なる新生児期の病態をNICCD (neonatal intrahepatic cholestasis caused by citrin deficiency) と名付けた。これまでCTLN2の新生児期症状の記載は乏しかったので、この発見は重要である。症状は、肝内胆汁うっ滞、黄疸遅延、低蛋白血症、凝固異常、多種アミノ酸血症(シトルリン、メチオニン、チロシン、スレオニンなど)、ガラクトース血症、低血糖、脂肪肝など非常に多彩である。NICCD症状は1歳前後で消失するので、何らかの適応・代償機構(グリセロリン酸shuttleやmalate citrate shuttleなど)が働いていると推察する。見かけ上健康に過ごす期間(10数年～数10年)を経て、代償機構の破綻など現在不明の機構によって、CTLN2の発症に至ると考えている。(4) 変異同定とマルチ診断法の確立:NICCDおよびCTLN2のSLC25A13遺伝子上に、新たに8種の変異(一部多型の可能性)を同定した。高頻度変異2種([I]と[II]で80%)を含めた9種に対して、GeneScan/SNaPshot法を利用したマルチ診断法を確立した。(5) 変異頻度検索:CTLN2症例の240 allele中90%に9種の変異を認め、従来の診断基準が正しかったことが証明でき、一疾患概念の樹立につながった。我々は20数年間に150例(年に6～7例)のCTLN2症例を解析・診断してきたが、発見から2年程度の短期間でNICCDと診断した症例は70例を超え、数の多さに驚いている。一方、健常者1372人の解析では、20人の保因者を認め、SLC25A13変異遺伝子が本邦において高頻度(1/20,000)に存在することを見いだした。以前報告したCTLN2の発症率 (1/100,000) とは大きく異なる。変異ホモ接合体は、① CTLN2発症、② てんかん、精神分裂病、うつ病など他疾患と誤診、③ 健康に過ごすと考えている。(6) Citrin欠損症の世界的な拡がり:日本人症例で見いだした変異が、中国人CTLN2患者ならびにベトナム人NICCD患者で認められた。さらに、パレスチナ人のNICCD症例では新規変異を同定し、患者は広範に存在することが示唆された。(7) Citrin欠損症の治療:NICCD症例では、全くの自然治癒例も認められるが、新生児肝炎の治療に準じて対処されている症例も多い。しかし、乳児期に肝移植を必要とした重症例(分類不能型チロシン血症と診断)も存在するので、必ずしも予後良好とは言い難い。それに対して、CTLN2症状は重篤であり、発症後急激な進行で死に至る場合も多いため、有効な治療法として肝移植がこれまで22例に適用された。肝移植は高額な医療費を必要とし、ドナーの問題もあるので、早急に新しい概念に基づいた治療法を開発する必要がある。
結論
SLC25A13遺伝子の発見は、CTLN2の病因解明に留まらず、NICCDなど長年原因不明であった他疾患の病因をも明らかにでき、それらが1つにつながったcitrin欠損症という疾患単位として捉えることを可能にした。CitrinならびにaralarがAGCであったということは、学術的にも重要な発見である。Citrin欠損症で見られる多彩な症状のいくつかは、AGC機能や代償機構などから推察可能となってきた。しかし、変異ホモ接合体は必ずNICCDを発症するのか、NICCDからCTLN2発症に至る機構や条件は何か、肝臓特異的ASS蛋白の低下は何故起こるのか、CTLN2の精神神経症状発症の機構は何が原因かなど、問題は山積している。早急に解決すべき課題は、発症機構とその要因(遺伝的素因と環境因子)の解明および治療法と予防法の開発である。これらの研究を実施する上で、疾患モデルマウスの樹立は必須であり、またすでに診断した変異ホモ接合体未発症者ならびにNICCD症例の詳細な経過観察とフォローアップが重要と考える。
公開日・更新日
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