文献情報
文献番号
200100448A
報告書区分
総括
研究課題名
ウイルス性慢性疾患の発症に関与する宿主遺伝子の解析
課題番号
-
研究年度
平成13(2001)年度
研究代表者(所属機関)
鈴木 哲朗(国立感染症研究所)
研究分担者(所属機関)
- 神代正道(久留米大学医学部)
- 松浦善治(大阪大学微生物病研究所)
- 小池和彦(東京大学医学部)
- 亀岡洋祐(国立感染症研究所)
研究区分
厚生科学研究費補助金 総合的プロジェクト研究分野 ヒトゲノム・再生医療等研究事業（ヒトゲノム分野）
研究開始年度
平成12(2000)年度
研究終了予定年度
平成14(2002)年度
研究費
30,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
一般にHCVまたはHBV感染に起因する慢性肝炎患者は、10年から30年の経過で30～40%が肝硬変さらには肝細胞癌へ移行するが、慢性肝疾患の進行には個人差が大きいことが知られている。感染ウイルス量の違いがその主要な原因となる症例は限られており、宿主細胞側の要因に左右されるケースが数多く存在すると考えられる。ウイルス慢性肝炎に対する、現在最も有効な治療法はIFN療法であるが、効果の期待できるC型肝炎の場合でも著効を示すのは30%程度であり、その治療効果は個人差が大きい。本研究では、ウイルス性慢性肝疾患の発症、進展に関わる宿主遺伝子、またIFN感受性に関連する宿主遺伝子をそれぞれ同定し、その情報を基に新たな予防法、個々の患者に最適な治療法を提供することを目的とする。
研究方法
HCV発現細胞、非発現細胞の遺伝子発現プロファイリングには、ヒト2304遺伝子をスポットしたDNAマイクロアレイを用いた。HCVコア蛋白をbaitとした酵母ツーハイブリッド法により、ヒト肝臓及び胎児脳由来cDNAライブラリーをスクリーニングしコア蛋白結合因子を検索した。細胞内シグナル伝達系の解析として、転写因子の活性をゲルシフト法 により行い、またin vitro kinase assayによりIKK、MAPK 等を測定した。分化度の異なる肝癌細胞株、肝癌組織を用いて、R__PCR法、flow cytometry法、免疫組織学的手法によりI型IF_レセプターAR-2鎖の発現解析を行なった。C型肝炎患者の遺伝子多型解析は以下のように実施した。厚生労働省等により定められた「ヒトゲノム・遺伝子解析研究に関する倫理指針」に準拠し当該試験研究機関の医学研究倫理審査委員会に申請し、インフォームドコンセントに係る手続きをした後、患者検体の収集を行った。血球画分から 全DNAを調製し、IL1β、TNF_遺伝子のプロモーター領域のゲノミックPCRを行いダイレクトシークエンシングにより遺伝子配列を決定した。
結果と考察
(1) HCV蛋白を発現する培養肝細胞、トランスジェニック (TG) マウス及び患者組織を用いた肝疾患関連遺伝子の探索
1-1. HCV発現培養肝細胞を用いた疾患関連遺伝子の探索
human EF1αプロモーター支配下でHCV遺伝子を発現させ、薬剤選択することによりHCV全蛋白を持続的に発現するヒト肝細胞株を作製した。この細胞株は少なくとも3ヶ月以上、HCV蛋白を安定に産生、プロセスすることを確認した。この細胞株を用いてcDNAマイクロアレイ法、RT-PCR法による遺伝子発現解析を行い、発現が亢進する遺伝子を17種類、低下する遺伝子を5種類同定した。細胞増殖に関わる遺伝子としては、forkhead転写因子FREAC-1、RNA結合蛋白PABP2、Ras suppressor Rsu-1がup-regulateし、Rb-associated protein RbAp48がdown-regulateしていた。また、HCVコア蛋白と細胞蛋白との相互作用をtwo-hybrid法、免疫沈降法などで解析し、コア蛋白とRXR_、proteasome subunit PA28γとの細胞内結合を明らかにした。コア蛋白とPA28γの局在が核で一致し、PA28γの局在を変化させたときコア蛋白の局在もPA28γの局在と常に一致することを見い出した。
1-2. HCV TGマウスを用いた遺伝子発現プロファイリング
HCVコア遺伝子TGマウスの肝組織を用いた遺伝子発現解析から、TNF_、IL1_の発現上昇を観察し、これらのサイトカインによって調節されている細胞内シグナル伝達系の解析からJNK-AP-1 pathwayの活性上昇を明らかにした。この結果より、コア蛋白の発現がTGマウスの肝臓内においてTNF-_, IL-1_などのサイトカインの発現を増加させ、細胞内シグナル伝達経路に変化を与え、下流の転写因子の活性を調節することで様々な遺伝子の発現に影響を与えていることが示唆された。
1-3. 肝癌組織および肝癌細胞株におけるIFN関連遺伝子の発現解析
種々の肝細胞癌症例について、IFNの作用発現に重要であるIFN-αレセプターAR-2鎖の発現、IFN-αの細胞増殖抑制作用を検討しこのIFNレセプターAR-2鎖の発現に個人差があることを明らかにした。また、11種類の分化度の異なる肝細胞癌細胞株と2種類の混合型肝癌株を用いた解析から、IFN-αが、肝癌細胞株に対しアポトーシスや細胞周期の進行停止などを誘導し直接的に増殖を抑制することが示された。また、レセプターの発現レベル、アポトーシス誘導能、細胞周期の進行停止誘導で細胞間較差が観察された。
(2) ヒト遺伝子解析用試料の収集
「ヒトゲノム・遺伝子解析研究に関する倫理指針」に則り、インフォームドコンセントのための説明文書及び同意文書をそれぞれ作成した。個人識別情報の匿名化プログラムをつくり、本プロジェクトのゲノム解析研究に用いる試料を収集するためのプロトコールを確立した。研究実施機関である国立感染症研究所、東京大学医学部附属病院、東京慈恵会医科大学病院において医学研究倫理委員会に申請し承認され、ウイルス性慢性肝疾患患者検体の収集を開始した。採取された検体は連結不可能匿名化を行った後、感染症研究所へ移送し遺伝子解析を実施している。検体、個人情報ともそれぞれの管理責任者によって厳格に管理されている。
(3) 遺伝子多型解析
IL1β、TNF_遺伝子のプロモーター領域についてC型肝炎の発症進行に関与する遺伝子変異の解析を行った。IL1βについてはプロモーター領域の2ケ所の変異(SNP)がC型肝炎発症に関与する可能性が示された。TNFαプロモーター領域についても変異の頻度は低いが、慢性肝炎から肝硬変/肝細胞がんへの移行の相対危険度は増加する傾向が観察された。IL1β、TNFαは前炎症性サイトカインとして炎症制御に関与し、ウイルスのクリアランスに重要な役割を演じていることが考えられる。両サイトカインプロモーターに見い出されたSNPは、C型肝炎の発症機序を解析する上で重要な足がかりになると考えられる。
1-1. HCV発現培養肝細胞を用いた疾患関連遺伝子の探索
human EF1αプロモーター支配下でHCV遺伝子を発現させ、薬剤選択することによりHCV全蛋白を持続的に発現するヒト肝細胞株を作製した。この細胞株は少なくとも3ヶ月以上、HCV蛋白を安定に産生、プロセスすることを確認した。この細胞株を用いてcDNAマイクロアレイ法、RT-PCR法による遺伝子発現解析を行い、発現が亢進する遺伝子を17種類、低下する遺伝子を5種類同定した。細胞増殖に関わる遺伝子としては、forkhead転写因子FREAC-1、RNA結合蛋白PABP2、Ras suppressor Rsu-1がup-regulateし、Rb-associated protein RbAp48がdown-regulateしていた。また、HCVコア蛋白と細胞蛋白との相互作用をtwo-hybrid法、免疫沈降法などで解析し、コア蛋白とRXR_、proteasome subunit PA28γとの細胞内結合を明らかにした。コア蛋白とPA28γの局在が核で一致し、PA28γの局在を変化させたときコア蛋白の局在もPA28γの局在と常に一致することを見い出した。
1-2. HCV TGマウスを用いた遺伝子発現プロファイリング
HCVコア遺伝子TGマウスの肝組織を用いた遺伝子発現解析から、TNF_、IL1_の発現上昇を観察し、これらのサイトカインによって調節されている細胞内シグナル伝達系の解析からJNK-AP-1 pathwayの活性上昇を明らかにした。この結果より、コア蛋白の発現がTGマウスの肝臓内においてTNF-_, IL-1_などのサイトカインの発現を増加させ、細胞内シグナル伝達経路に変化を与え、下流の転写因子の活性を調節することで様々な遺伝子の発現に影響を与えていることが示唆された。
1-3. 肝癌組織および肝癌細胞株におけるIFN関連遺伝子の発現解析
種々の肝細胞癌症例について、IFNの作用発現に重要であるIFN-αレセプターAR-2鎖の発現、IFN-αの細胞増殖抑制作用を検討しこのIFNレセプターAR-2鎖の発現に個人差があることを明らかにした。また、11種類の分化度の異なる肝細胞癌細胞株と2種類の混合型肝癌株を用いた解析から、IFN-αが、肝癌細胞株に対しアポトーシスや細胞周期の進行停止などを誘導し直接的に増殖を抑制することが示された。また、レセプターの発現レベル、アポトーシス誘導能、細胞周期の進行停止誘導で細胞間較差が観察された。
(2) ヒト遺伝子解析用試料の収集
「ヒトゲノム・遺伝子解析研究に関する倫理指針」に則り、インフォームドコンセントのための説明文書及び同意文書をそれぞれ作成した。個人識別情報の匿名化プログラムをつくり、本プロジェクトのゲノム解析研究に用いる試料を収集するためのプロトコールを確立した。研究実施機関である国立感染症研究所、東京大学医学部附属病院、東京慈恵会医科大学病院において医学研究倫理委員会に申請し承認され、ウイルス性慢性肝疾患患者検体の収集を開始した。採取された検体は連結不可能匿名化を行った後、感染症研究所へ移送し遺伝子解析を実施している。検体、個人情報ともそれぞれの管理責任者によって厳格に管理されている。
(3) 遺伝子多型解析
IL1β、TNF_遺伝子のプロモーター領域についてC型肝炎の発症進行に関与する遺伝子変異の解析を行った。IL1βについてはプロモーター領域の2ケ所の変異(SNP)がC型肝炎発症に関与する可能性が示された。TNFαプロモーター領域についても変異の頻度は低いが、慢性肝炎から肝硬変/肝細胞がんへの移行の相対危険度は増加する傾向が観察された。IL1β、TNFαは前炎症性サイトカインとして炎症制御に関与し、ウイルスのクリアランスに重要な役割を演じていることが考えられる。両サイトカインプロモーターに見い出されたSNPは、C型肝炎の発症機序を解析する上で重要な足がかりになると考えられる。
結論
(1) HCVコアTGマウスの遺伝子発現プロファイリングから、肝疾患関連遺伝子としてIL1β、TNF_を選択しC型肝炎患者検体についてSNP解析を行った。両サイトカインのプロモーター領域にC型肝炎の発症あるいは進展に関与する可能性のあるSNPを2ケ所ずつ同定した。
(2) HCV蛋白を持続的に産生する細胞株、分化度の異なる種々の肝癌細胞を用いた遺伝子発現プロファイリング、ツーハイブリッド法によるHCV蛋白結合因子の検索などから、肝疾患の発症、進展に関わる候補遺伝子あるいはIFN感受性に関連する候補遺伝子が20数種類選択した。これらの遺伝子について患者検体による多型解析を実施する。
(2) HCV蛋白を持続的に産生する細胞株、分化度の異なる種々の肝癌細胞を用いた遺伝子発現プロファイリング、ツーハイブリッド法によるHCV蛋白結合因子の検索などから、肝疾患の発症、進展に関わる候補遺伝子あるいはIFN感受性に関連する候補遺伝子が20数種類選択した。これらの遺伝子について患者検体による多型解析を実施する。
公開日・更新日
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