文献情報
文献番号
200100444A
報告書区分
総括
研究課題名
冠動脈攣縮原因遺伝子のゲノム解析と分子病態の解明(総括研究報告書)
課題番号
-
研究年度
平成13(2001)年度
研究代表者(所属機関)
小池 城司(九州大学医学部附属病院循環器内科)
研究分担者(所属機関)
- 下川宏明(九州大学大学院医学研究院循環器内科学)
- 多田英生(九州大学医学部附属病院循環器内科・ヒューマンサイエンス振興財団リサーチレジデント)
研究区分
厚生科学研究費補助金 総合的プロジェクト研究分野 ヒトゲノム・再生医療等研究事業（ヒトゲノム分野）
研究開始年度
平成12(2000)年度
研究終了予定年度
平成14(2002)年度
研究費
10,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
虚血性心疾患は、遺伝子異常による遺伝的要因及び食事・生活環境などの非遺伝的要因が複雑に関与する生活習慣病(多因子疾患)の代表的なものの一つであり、その原因解明およびより効果的な治療法の確立は国民の健康増進を計る上で重要な課題である。虚血性心疾患の原因には、冠動脈硬化による器質的な狭窄と機能的な冠動脈攣縮の二つがあり、そのうち冠動脈攣縮による虚血性心疾患に対する遺伝・ゲノム解析はほとんどなされていない。冠動脈攣縮が、狭心症・急性心筋梗塞・突然死などの虚血性心疾患全般の成因に深く関与し、また、冠攣縮性虚血性心疾患は欧米に比べて特に日本人に非常に多いことは以前より認められている。そこで本研究では冠動脈攣縮の遺伝・ゲノム解析を進め、原因遺伝子を同定することで、その原因解明およびより効果的な治療法の確立を目指すことを目的とする。
研究方法
本研究は遺伝子多型の同定および血液からのDNA抽出とPCR法による遺伝子多型の決定及びその結果を用いた遺伝学・ゲノム学的解析が中心となる。具体的には以下の方法で行う。
1. 冠攣縮性虚血性心疾患のリクルートおよびその血液サンプルからのDNA抽出
これまでに我々が確立した診断方法により冠攣縮性虚血性心疾患患者群(冠攣縮性狭心症患者群、微小血管狭心症患者群)およびその対照群をリクルートしてきた。本研究は倫理面への配慮として「ヒトゲノム・遺伝子解析研究に関する倫理指針(平成13年3月29日文部科学省・厚生労働省・経済産業省告知第1号)」を遵守することとする。具体的には、本研究の目的、内容、人権擁護上の配慮、研究方法による研究対象者に対する不利益、危険性の排除を説明し、承諾を得られた研究対象者のみからDNA抽出用の採血を施行する。また、本研究の研究プロトコールについては、九州大学大学院医学研究院の遺伝子解析ガイドラインに沿って実施する。なお、この研究プロトコールは、九州大学大学院医学研究院のヒトゲノム・遺伝子解析倫理審査専門委員会において審議され、承認されたものである。
2. 候補遺伝子群の遺伝子多型の同定
我々のこれまでの研究結果から、血管平滑筋収縮に関わるProtein kinase CやRho/Rho-kinaseを含むシグナル伝達機構が冠動脈攣縮に重要な役割を果たしている事を明らかにしてきた。そこで、Protein kinase CやRho/Rho-kinaseを含むシグナル伝達機構に関与する蛋白質をコードする各遺伝子の遺伝子多型を同定する。
3. 冠動脈攣縮の遺伝学・ゲノム学的解析
1で述べた冠攣縮性虚血性心疾患患者群(冠攣縮性狭心症患者群、微小血管狭心症患者群)およびその対照群において2で同定した候補遺伝子群の遺伝子多型を決定し、それらの遺伝子が冠攣縮に関与するか否かを関連解析により検討する。さらに、本研究で同定される様々な遺伝子多型のパターンと様々な薬剤の冠攣縮性狭心症及び微小血管狭心症に対する治療効果を解析する。それに加えて、日本人の患者集団およびCaucasianの患者集団(スイス・チューリッヒ大学との共同研究であるENCORE I研究)における冠攣縮の遺伝的要因を比較検討することにより、冠攣縮に関わる遺伝的背景の人種差を解明する。候補遺伝子(群)の遺伝子多型による相関を検出できなかった場合は、300-400の遺伝マーカー(SSLPs等)を用いて全ゲノムを検索する。
1. 冠攣縮性虚血性心疾患のリクルートおよびその血液サンプルからのDNA抽出
これまでに我々が確立した診断方法により冠攣縮性虚血性心疾患患者群(冠攣縮性狭心症患者群、微小血管狭心症患者群)およびその対照群をリクルートしてきた。本研究は倫理面への配慮として「ヒトゲノム・遺伝子解析研究に関する倫理指針(平成13年3月29日文部科学省・厚生労働省・経済産業省告知第1号)」を遵守することとする。具体的には、本研究の目的、内容、人権擁護上の配慮、研究方法による研究対象者に対する不利益、危険性の排除を説明し、承諾を得られた研究対象者のみからDNA抽出用の採血を施行する。また、本研究の研究プロトコールについては、九州大学大学院医学研究院の遺伝子解析ガイドラインに沿って実施する。なお、この研究プロトコールは、九州大学大学院医学研究院のヒトゲノム・遺伝子解析倫理審査専門委員会において審議され、承認されたものである。
2. 候補遺伝子群の遺伝子多型の同定
我々のこれまでの研究結果から、血管平滑筋収縮に関わるProtein kinase CやRho/Rho-kinaseを含むシグナル伝達機構が冠動脈攣縮に重要な役割を果たしている事を明らかにしてきた。そこで、Protein kinase CやRho/Rho-kinaseを含むシグナル伝達機構に関与する蛋白質をコードする各遺伝子の遺伝子多型を同定する。
3. 冠動脈攣縮の遺伝学・ゲノム学的解析
1で述べた冠攣縮性虚血性心疾患患者群(冠攣縮性狭心症患者群、微小血管狭心症患者群)およびその対照群において2で同定した候補遺伝子群の遺伝子多型を決定し、それらの遺伝子が冠攣縮に関与するか否かを関連解析により検討する。さらに、本研究で同定される様々な遺伝子多型のパターンと様々な薬剤の冠攣縮性狭心症及び微小血管狭心症に対する治療効果を解析する。それに加えて、日本人の患者集団およびCaucasianの患者集団(スイス・チューリッヒ大学との共同研究であるENCORE I研究)における冠攣縮の遺伝的要因を比較検討することにより、冠攣縮に関わる遺伝的背景の人種差を解明する。候補遺伝子(群)の遺伝子多型による相関を検出できなかった場合は、300-400の遺伝マーカー(SSLPs等)を用いて全ゲノムを検索する。
結果と考察
1.本研究における患者・対照群のリクルートおよびそのDNA抽出について
本研究ではこれまでに、以下に示すような患者群をリクルートしてきた;冠攣縮性狭心症240名、微小血管狭心症111名、対照61名(動脈硬化性狭心症、冠攣縮性狭心症及び微小血管狭心症が否定された症例)。そのうち、DNA解析のインフォームドコンセントが得られた患者の血液サンプルのみから現在DNA抽出を行っているところである(これまでに141名の血液サンプルからDNAを抽出済)。当科では、約50名/年の本研究の対象となる患者群が新たに診断されており、今年度だけで本研究に73名の患者・対照群をリクルートできた。今後も引き続きこのような患者・対照群を逐次本研究に加えていく予定である。
2.候補遺伝子群遺伝子多型同定について
これまでの動物モデルを用いた冠動脈攣縮の成因に関する我々の研究結果から、血管平滑筋収縮に関わるProtein kinase CやRho/Rho-kinaseを含むシグナル伝達機構の異常が関与していることを明らかにしてきた。本研究においては、まずその中心的な分子であるRho AおよびRho-kinaseの遺伝子多型の探索を行い、昨年度はそれらの遺伝子の新規遺伝子多型を同定した。本研究では、候補遺伝子群の遺伝子多型について、まずデータベースサーチを行い、遺伝子発現や遺伝子機能に影響を与えるcSNPやrSNPが報告されている場合は、まず日本人での確認を行い、そのような報告がない場合には、PCR法やRT-PCR法によりそれら遺伝子のプロモーター・翻訳領域のクローニングおよびシークエンスを行い遺伝子多型を探索する戦略を用いている。この方法で、今年度もProtein kinase C alphaおよびdelta遺伝子の新規遺伝子多型を同定した。今後も他の候補遺伝子について、それらの遺伝子多型の探索を引き続き行なう予定である。ヒトゲノム計画により、遺伝子多型の情報も整備されてきているが、その基礎が日本人以外の遺伝情報であり、それが日本人には必ずしも利用できない事が指摘されており、本研究で同定された遺伝子多型が報告されていないことからも、このことが確認された。このことより、これらの候補遺伝子群の日本人版遺伝子多型を同定する事がより重要であると考える。
3.冠動脈攣縮の遺伝学・ゲノム学的解析について
1で述べたDNAサンプルを用いて、本研究で我々が同定したRho-kinase遺伝子K310N多型、および既知のAngiotensin converting enzyme遺伝子I/D多型、Angiotensinogen遺伝子M235T多型、Angiotensin II type I receptor遺伝子A1166C多型、endothelial Nitric Oxide Synthase遺伝子T-786C多型についての遺伝子多型を決定し、冠動脈攣縮の遺伝学・ゲノム学的解析を開始した。これまでの解析結果からはRho-kinase遺伝子K310N多型が冠動脈攣縮に相関する傾向を認めた。また、本研究ではENCORE I研究のDNAサンプルを用いた冠動脈攣縮の遺伝学・ゲノム学的解析も開始したところである。
4.本研究の今後
これまでに患者・対照群のDNA抽出が開始され、候補遺伝子群の遺伝子多型も同定されてきており、今後も引き続いてそれらを用いての冠動脈攣縮の遺伝学・ゲノム学的解析を行い、その原因解明およびより効果的な治療法の確立を目指す。
本研究ではこれまでに、以下に示すような患者群をリクルートしてきた;冠攣縮性狭心症240名、微小血管狭心症111名、対照61名(動脈硬化性狭心症、冠攣縮性狭心症及び微小血管狭心症が否定された症例)。そのうち、DNA解析のインフォームドコンセントが得られた患者の血液サンプルのみから現在DNA抽出を行っているところである(これまでに141名の血液サンプルからDNAを抽出済)。当科では、約50名/年の本研究の対象となる患者群が新たに診断されており、今年度だけで本研究に73名の患者・対照群をリクルートできた。今後も引き続きこのような患者・対照群を逐次本研究に加えていく予定である。
2.候補遺伝子群遺伝子多型同定について
これまでの動物モデルを用いた冠動脈攣縮の成因に関する我々の研究結果から、血管平滑筋収縮に関わるProtein kinase CやRho/Rho-kinaseを含むシグナル伝達機構の異常が関与していることを明らかにしてきた。本研究においては、まずその中心的な分子であるRho AおよびRho-kinaseの遺伝子多型の探索を行い、昨年度はそれらの遺伝子の新規遺伝子多型を同定した。本研究では、候補遺伝子群の遺伝子多型について、まずデータベースサーチを行い、遺伝子発現や遺伝子機能に影響を与えるcSNPやrSNPが報告されている場合は、まず日本人での確認を行い、そのような報告がない場合には、PCR法やRT-PCR法によりそれら遺伝子のプロモーター・翻訳領域のクローニングおよびシークエンスを行い遺伝子多型を探索する戦略を用いている。この方法で、今年度もProtein kinase C alphaおよびdelta遺伝子の新規遺伝子多型を同定した。今後も他の候補遺伝子について、それらの遺伝子多型の探索を引き続き行なう予定である。ヒトゲノム計画により、遺伝子多型の情報も整備されてきているが、その基礎が日本人以外の遺伝情報であり、それが日本人には必ずしも利用できない事が指摘されており、本研究で同定された遺伝子多型が報告されていないことからも、このことが確認された。このことより、これらの候補遺伝子群の日本人版遺伝子多型を同定する事がより重要であると考える。
3.冠動脈攣縮の遺伝学・ゲノム学的解析について
1で述べたDNAサンプルを用いて、本研究で我々が同定したRho-kinase遺伝子K310N多型、および既知のAngiotensin converting enzyme遺伝子I/D多型、Angiotensinogen遺伝子M235T多型、Angiotensin II type I receptor遺伝子A1166C多型、endothelial Nitric Oxide Synthase遺伝子T-786C多型についての遺伝子多型を決定し、冠動脈攣縮の遺伝学・ゲノム学的解析を開始した。これまでの解析結果からはRho-kinase遺伝子K310N多型が冠動脈攣縮に相関する傾向を認めた。また、本研究ではENCORE I研究のDNAサンプルを用いた冠動脈攣縮の遺伝学・ゲノム学的解析も開始したところである。
4.本研究の今後
これまでに患者・対照群のDNA抽出が開始され、候補遺伝子群の遺伝子多型も同定されてきており、今後も引き続いてそれらを用いての冠動脈攣縮の遺伝学・ゲノム学的解析を行い、その原因解明およびより効果的な治療法の確立を目指す。
結論
本研究は、日本人に非常に多い冠攣縮性虚血性心疾患について、我々のこれまでの基礎および臨床研究を基に、遺伝学的解析を進め、その原因遺伝子を同定することを目的にしている。今年度における本研究も順調に進行しており、それを引き続き進めることで各種冠動脈攣縮における遺伝的要因を明らかにでき、冠攣縮性虚血性心疾患に対する新たな治療法・新薬の開発や、現在ある薬剤のより効果的な使用につながり、国民の福祉に役立つと考える。特に本研究で同定されたRho-kinase遺伝子K310N多型はRho-kinaseのcatalytic domain内の塩基性アミノ酸から非荷電性アミノ酸への変異を伴い、このことによりRho-kinaseの機能が変化する可能性が高い。また、本研究の遺伝解析でRho-kinase遺伝子K310N多型が冠動脈攣縮に相関する傾向を認めており、Rho-kinase遺伝子異常が冠動脈攣縮の原因である可能性が出てきた。そのため、現在このアミノ酸変異が実際にRho-kinaseの機能に変化を生じさせるかを培養平滑筋を用いた系で検討する実験も進行させているところである。
公開日・更新日
公開日
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更新日
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