アポトーシス抑制作用を有する新規抗エイズ薬の開発

文献情報

• 文献番号: 200001038A
• 報告書区分: 総括
• 研究課題名: アポトーシス抑制作用を有する新規抗エイズ薬の開発
• 課題番号: -
• 研究年度: 平成12(2000)年度
• 研究代表者(所属機関): 吉野 公一郎(日本オルガノン株式会社医薬研究所)

研究分担者(所属機関)

• 井上紳太郎(鐘紡株式会社基礎科学研究所)
• 榧垣伸彦(順天堂大学医学部)
• 寺尾恵治(国立感染症研究所筑波医学実験用霊長類センター)
• 東山繁樹(大阪大学医学部)
• 松野健二(東京理科大学基礎工学部)

• 研究区分: 厚生科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 創薬等ヒューマンサイエンス総合研究事業
• 研究開始年度: 平成10(1998)年度
• 研究終了予定年度: 平成12(2000)年度
• 研究費: 35,000,000円
• 研究者交替、所属機関変更: -

研究報告書（概要版）

研究目的

エイズ患者はHIVウィルス感染後、CD4陽性T(CD4+T)細胞が特異的に減少し、免疫不全となり感染症により死亡する。従ってCD4+T細胞の減少を止めることができれば病態の進行を阻止できる可能性がある。　CD4+T細胞の減少はHIVウィルスが直接CD4+T細胞を破壊するのではなく、何らかの因子を介したバイスタンダー効果によるものと想定されていた。本研究者等は、これまでの研究で、SIV感染サルのCD4+T細胞の減少に可溶型Fasリガンド(sFasL)を介するアポトーシスが関与していることを明らかにしてきた。しかしながら、sFasLの機能に関しては、アポトーシスや炎症を惹起する機能的な蛋白である説がある一方、正常細胞に対するアポトーシス惹起能が弱いので、アポトーシスを防御する機能を担っているとする説があり、これまで不明確であった。そこで本研究では野生型FasL, sFasL, ncFasL(切断部位を除き膜から切り出されないようにしたFasL)をトランスフェクトした細胞を作製し、機能解析を行った。FasLは、T細胞やマクロファージ等からメタロプロテアーゼで可溶化されることがわかっており、本研究では、このメタロプロテアーゼをクローニングするとともに、有効な阻害薬を見いだしその効果をSIV感染サルで証明することを目的としている。本研究者がこれまで仮説の検証に用いてきたFasL　shedding酵素阻害を示すMMP阻害薬は、阻害スペクトラムが広く、類似化合物が抗腫瘍薬として臨床試験に供されているが、筋肉痛をはじめとする多くの副作用が認められている。 また、これまでに評価してきた化合物は、経口吸収性が無く水に対する溶解度も低い、等の問題を有しており実用的な化合物ではなかった。一方、この数年の間に、細胞膜からの蛋白の切り出し(shedding)に関する知見が急速に集積され、FasLのようなTNFファミリーサイトカインのみならず、接着分子や増殖因子など多くの膜タンパクが、似たような酵素によりsheddingを受けることが明らかとなり、FasL　shedding酵素阻害薬を安全に用いるためには、FasL shedding酵素を選択的に阻害する薬物を見出すことが重要であることが益々確かとなると同時に、選択的な阻害薬を見いだすことは、当初予想されていたよりも遙かに難しい課題であることも明らかになってきた。本研究グループは、選択的な化合物を見いだすために、MMP阻害作用、TNFファミリー, EGFファミリーshedding阻害を評価するハイスループットスクリーニング系を確立し、多数の化合物を評価しながら構造活性相関を明らかにし、選択性、物性の優れた実用レベルの化合物の創製を目指した。さらに、現時点ではブロードスペクトルを有するMMP阻害薬の筋肉痛をはじめとする多くの副作用が、MMPの阻害に基づくのかあるいは膜タンパクの切り出しによるのか不明であり、安全に使用できる抑制薬の持つべきプロフィルが不明である。そこで、阻害薬のグローバルな副作用を簡便に評価する系として、ADAM型メタロプロテアーゼが発生時に重要な役割を演じているショウジョウバエを用いる評価系を検討した。

研究方法

新規FasL shedding阻害薬約100化合物を合成、評価して経口投与可能な阻害薬を選び、SIV感染サルに10mg/kgの割合で2週間連続経口投与して、血中のsFasL量、CD4+T細胞数に与える影響を評価した。さらに、野生型FasL, sFasL, ncFasL(切断部位を除き膜から切り出されないようにしたFasL)をトランスフェクトした細胞を用いてsFasLの機能を評価し
た。　また、FasLのshedding阻害作用を有する薬物を探索子としてクローニングを試みた結果、メタロプロテアーゼDPPIIIが単離された。　ドミナントネガティブ法によりDPPIIIがFasLを切断するか否か検討した。　阻害薬のグローバルな副作用を簡便に評価する系として、ADAM型メタロプロテアーゼが発生時に重要な役割を演じているショウジョウバエを用いる評価系を検討した。

結果と考察

これまでに、sFasLの機能については、様々な説が有ったが、今回の検討で機能的な蛋白であることが確認された。また、SIV感染サルに今回新たに見いだされた経口投与可能な新規FasLshedding阻害薬OJ-R8898を10mg/kgの割合で2週間連続経口投与して、血中のsFasL量、CD4+T細胞数に与える影響を評価した結果、sFasLの低下にともなってCD4+T細胞レベルの上昇が認められた。　これら増加するCD4+T細胞の表面マーカーを解析すると、FasまたはCD29陽性のCD4+T細胞が増加していることが明らかとなった。この結果からも、SIVではマクロファージやリンパ球から遊離される機能的なsFasLがFas陽性CD4+T細胞を破壊していることが裏付けられた。　以上の結果より、FasL shedding阻害薬が、HIV感染者の免疫能を保つ新しいエイズ治療薬となる可能性が示唆された。一方、この数年の間に、細胞膜からの蛋白の切り出し(shedding)に関する知見が急速に集積され、FasLのようなTNFファミリーサイトカインのみならず、接着分子や増殖因子など多くの膜タンパクが、似たような酵素によりsheddingを受けることが明らかとなり、FasL shedding酵素阻害薬を安全に用いるためには、FasL shedding酵素を選択的に阻害する薬物を見出すことが重要であることが益々確かとなると同時に、選択的な阻害薬を見いだすことは、当初予想されていたよりも遙かに難しい課題であることも明らかになってきた。FasLのsheddingを選択的にに抑制する薬物を開発するためには、FasLのsheddingを行っている酵素を単離し、それを用いてドラッグデザイン、評価を行うのが最も有力な手段である。そこで、FasLのshedding阻害作用を有する薬物を探索子としてクローニングを試みた結果、メタロプロテアーゼDPPIIIが単離された。ドミナントネガティブ法によりDPPIIIがFasLを切断するか否か検討した結果、DPPIIIはFasLを切断しないことが明らかとなった。現時点では、FasLを特異的に阻害する薬物を得るのはきわめて難しく、ブロード～ミドルスペクトル阻害薬しか得られなかった。このような阻害薬が、生体のどのような機能を抑制し、どのような副作用を発現するのか現時点では全く不明である。しかしながら、この点が今後実用的なFasL shedding阻害薬を早期に開発する際のポイントとなる。そこで、阻害薬のグローバルな副作用を簡便に評価する系として、ADAM型メタロプロテアーゼが発生時に重要な役割を演じているショウジョウバエを用いる評価系を確立した。今後、様々なスペクトル有する阻害薬をこの系で評価し、阻害と副作用の相関が明らかになれば、ミドルスペクトル化合物の中から実用的な化合物を選ぶことができる可能性がある。

結論

本年度の研究で、SIVではマクロファージやリンパ球から遊離される機能的なsFasLがFas陽性CD4+T細胞を破壊していることが裏付けられ、FasL のshedding阻害薬が、HIV感染者の免疫能を保つ新しいエイズ治療薬となる可能性が確認された。一方、FasLのsheddingだけを選択的に阻害する薬物を得ることはきわめて難しいことが明らかとなった。今後は、阻害スペクトルが少しでも狭い薬物を合成する努力を続けるとともに、ミドルスペクトル阻害薬が、生体のどのような機能を抑制し、どのような副作用を発現するのかを見極める努力も必要である。今後、本プロジェクトで蓄積された知見、開発されたハイスループットスクリーニング系、副作用評価システムを活用して、早期に実用的なFasLshedding阻害薬が開発されることを期待する。

公開日・更新日

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