文献情報
文献番号
200000985A
報告書区分
総括
研究課題名
薬物代謝活性の多型性とハイリスク患者における薬物評価に関する研究
課題番号
-
研究年度
平成12(2000)年度
研究代表者(所属機関)
大野 泰雄(国立医薬品食品衛生研究所)
研究分担者(所属機関)
- 山添 康(東北大学薬学部)
- 杉山雄一(東京大学薬学部)
- 池田敏彦(三共(株))
- 馬場隆彦(塩野義製薬(株))
- 丹波俊朗(藤沢薬品工業(株))
- 大石哲久(中外製薬(株))
- 藤井敏彦(大日本製薬(株))
研究区分
厚生科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 創薬等ヒューマンサイエンス総合研究事業
研究開始年度
平成12(2000)年度
研究終了予定年度
-
研究費
15,727,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
薬物代謝酵素には遺伝多型性があり、薬物の代謝活性が通常より低かったり高い者がいる。また、併用薬や食物成分との薬物相互作用によって特定の代謝酵素活性が低い者がいる。このようなヒトはいわゆるハイリスクな状態にあり、医薬品の副作用が強く現れたり、逆に十分な作用が現れず、治療に重大な支障を来す可能性がある。このような状況を予測するために、本研究では代謝酵素の遺伝多型や酵素阻害・誘導についての基礎的な研究を積み重ねること、in vitroで個々の薬物の代謝に関与する酵素を分子種レベルで明らかにすること、およびin vitroの結果からin vivoを予測するための理論構築を行う事を目的とした。
研究方法
ヒト肝ミクロソームおよび上清画分を酵素源とし、TegafurおよびDoxifluridineから5-FUを生成する酵素活性を測定した。また、雄性ウサギの腸管上皮の粘膜からミクロソームを調製し代謝活性を測定した。Maxacalcitol代謝はラットおよびヒトCYP24を発現した大腸菌膜画分を用いた再構成系を用いて検討した。雄マーモセットに種々のP450 誘導剤を投与し、肝の薬物代謝酵素活性を測定した。またマーモセットから初代培養肝細胞を調整した。雄性ウサギにGrape fruit juice(GFJ)を1日2回各10 ml/kgの用量で5日間経口投与したのちに、ニフェジピンを投与し相互作用の発現の有無を検討した。ヒト肝ミクロソームを用いて、in vitro評価系にヒト血清アルブミン(HSA)やラット肝可溶性画分を添加し、各種条件下で薬物の非結合分率(fu)を平衡透析法で算出し、これを用いて非結合薬物濃度に基づくKmやKi値を計算した。血中から肝への取り込み能の測定には遊離肝細胞、肝から胆汁中への排泄過程の解析には胆管側膜ベシクル(CMV)を用いた。相互作用のモデルとして抗癌剤methotrexate (MTX)の胆汁排泄に対するprobenecidの効果を例にとり、ラットに両薬物を定速投与することによって実験的に相互作用を起こし、実測された阻害剤濃度とin vitroから求められた阻害定数(Ki)から、in vivo相互作用の予測を試みた。
結果と考察
ヒト酵素による薬物代謝について
1) tegafur (FT)から5-FUへの変換活性は、ヒト肝ミクロソームにおいては45-808 pmol/min/mg protein未満であり、上清画分においては23-104であった。一方、doxifluridine (DF)から5-FUへの変換活性は、ミクロソームでは10-160未満であり、上清画分では、1090-5250であった。FTはDFより自然分解速度が速く、血漿中等での分解も考慮に入れ、全体の5-FU生成に対する各因子の寄与率を評価することが重要であると思われた。2)Maxacalcitolは活性型ビタミンD3の22位を酸素に置換した誘導体でヒトCYP24発現系では代謝物である20S(OH)-hexanor体、24R(OH)体、24-oxo体の順で生成が認められた。また、ヒトとラットで代謝経路が異なっていた。
腸管の薬物代謝酵素について
1)ウサギ腸管ミクロソームにおいてCYP3Aの他にCYP1A1、 CYP2C、 CYP2Dの発現を認めた。いずれも十二指腸における含量が肝の3割程度と最も多く、空腸、回腸の順に減少した。腸管には、肝特異的な分子種であるCYP1A2の発現は認められなかった。また、チトクロームb5やNADPH-P450リダクターゼは腸管においても肝とほぼ同程度発現していた。ウサギ腸管のP450はラット等に比べ比較的安定であり、実験操作に用いやすいことが明らかとなった。ただし、ウサギではCYP1A1が腸管で多く発現していた。
2)サル小腸ミクロソームから高いEbastine水酸化活性を有するP450MI-2を精製し、内部アミノ酸配列を決定した。P450MI-2はヒトCYP4F分子種と高いホモロジーを示した。ヒト小腸ミクロソームのEbastine水酸化活性に対する抗ヒトCYP4F抗体の影響は、約20%程度とサル小腸ミクロソームに比べ小さかった。即ち、CYP4F分子種がサル小腸ミクロソーム中のEbastine水酸化を行う主代謝酵素であることが明らかとなったが、ヒト小腸ミクロソームでは他の酵素の関与が示唆された。
酵素誘導について
マーモセットにおいて3-MethylcholanthreneによるCYP1A1の誘導、PhenobarbitalおよびRIFによるCYP3A4の誘導が観察されたが、DexamethasonおよびPCNによるCYP3A4誘導およびClofibrateによるCYP4A1誘導は観察されず、P450誘導に関してヒトに近い性質を示した。また、マーモセット初代培養肝細ではRIFにより明らかにCYP3A4が誘導されたが、PCNとTroglitazoneでは誘導は見られなかった。今回の結果はCYP3A4の誘導の検討に初代培養マーモセット肝細胞が有用であることを示した。
薬物相互作用について
1)ウサギにおいてNifedipine のCmax到達時における血中濃度は、GFJ投与群では非投与群の1.7倍の値を示した。一方、消失相におけるT1/2は投与群、非投与群で大きな差は認められなかった。この結果は、ヒトモデルとしてのウサギの有用性を示している。一方、GFJ投与により腸管のCYP3A4活性は29%に減少した。このことが、Nifedipine の循環血中AUCを上昇させた原因であると推定された。
2)アルブミンや肝可溶性画分を薬物代謝の反応系に添加することの意義を検討したところ、HSAもしくはラット肝可溶性画分を添加すると、TerfenadineおよびDiclofenacのfuは減少し、これに伴なって酵素活性も減弱した。Diclofenacでは、Km,uはラット肝可溶性画分添加の影響を受けなかったが、それ以外ではKm,uが減少し、見かけ上結合している薬物も代謝されることを示した。さらにMiconazole によるCYP2C9の阻害とKetoconazole によるCYP3A4の阻害に及ぼす影響について調べた。蛋白の添加によりそれぞれのfuと阻害能は減少したが、Miconazoleではラット肝可溶性画分を添加した場合に、Ketoconazole ではHSA添加時に、Ki,uが減少し、見かけ上結合している薬物も酵素を阻害することを示した。従来、非結合型の薬物のみが、代謝反応や酵素阻害に利用されると考えられてきたが、非結合型の薬物のみならず、見かけ上、タンパク質に結合した薬物が代謝を受ける場合や酵素を阻害する場合があることが明らかになった。
in vitroからin vivoの予測について
胆汁排泄過程における相互作用の予測方法の確立を目的として、血液側からの肝細胞への取り込みを遊離肝細胞、肝細胞から胆汁への排泄をCMVを用い、それぞれ阻害の程度を評価した。そこから得られたKiを用い、in vivoでの排泄阻害の程度を予測するため、別途in vivoにおいても相互作用のモデルを構築したところ、PBDはMTXの胆汁排泄および肝取り込みを投与量依存的に低下させたことから、モデルの構築が確認された。取り込み側、排泄側の個々の膜透過過程については、in vitroで測定したKiを用い定量的な予測が可能であることが明らかとなった。さらに構成した式を用いることにより、netの胆汁排泄についても相互作用の予測が可能であることが示唆された。構成した式を用いる大きな問題点として、阻害剤の肝臓中非結合型濃度の必要な点が挙げられるが、これはヒトにおいては得るのが困難な情報である。そこで、血漿中の非結合型濃度を用いて予測を行ったところ、このケースでも予測値は実測値に近く、予測の妥当性が示唆された。しかし阻害剤によっては、肝細胞内に能動輸送によって濃縮されている可能性もある。肝細胞内の非結合型濃度の予測には定数倍のマージンをつけることも必要かもしれない。
1) tegafur (FT)から5-FUへの変換活性は、ヒト肝ミクロソームにおいては45-808 pmol/min/mg protein未満であり、上清画分においては23-104であった。一方、doxifluridine (DF)から5-FUへの変換活性は、ミクロソームでは10-160未満であり、上清画分では、1090-5250であった。FTはDFより自然分解速度が速く、血漿中等での分解も考慮に入れ、全体の5-FU生成に対する各因子の寄与率を評価することが重要であると思われた。2)Maxacalcitolは活性型ビタミンD3の22位を酸素に置換した誘導体でヒトCYP24発現系では代謝物である20S(OH)-hexanor体、24R(OH)体、24-oxo体の順で生成が認められた。また、ヒトとラットで代謝経路が異なっていた。
腸管の薬物代謝酵素について
1)ウサギ腸管ミクロソームにおいてCYP3Aの他にCYP1A1、 CYP2C、 CYP2Dの発現を認めた。いずれも十二指腸における含量が肝の3割程度と最も多く、空腸、回腸の順に減少した。腸管には、肝特異的な分子種であるCYP1A2の発現は認められなかった。また、チトクロームb5やNADPH-P450リダクターゼは腸管においても肝とほぼ同程度発現していた。ウサギ腸管のP450はラット等に比べ比較的安定であり、実験操作に用いやすいことが明らかとなった。ただし、ウサギではCYP1A1が腸管で多く発現していた。
2)サル小腸ミクロソームから高いEbastine水酸化活性を有するP450MI-2を精製し、内部アミノ酸配列を決定した。P450MI-2はヒトCYP4F分子種と高いホモロジーを示した。ヒト小腸ミクロソームのEbastine水酸化活性に対する抗ヒトCYP4F抗体の影響は、約20%程度とサル小腸ミクロソームに比べ小さかった。即ち、CYP4F分子種がサル小腸ミクロソーム中のEbastine水酸化を行う主代謝酵素であることが明らかとなったが、ヒト小腸ミクロソームでは他の酵素の関与が示唆された。
酵素誘導について
マーモセットにおいて3-MethylcholanthreneによるCYP1A1の誘導、PhenobarbitalおよびRIFによるCYP3A4の誘導が観察されたが、DexamethasonおよびPCNによるCYP3A4誘導およびClofibrateによるCYP4A1誘導は観察されず、P450誘導に関してヒトに近い性質を示した。また、マーモセット初代培養肝細ではRIFにより明らかにCYP3A4が誘導されたが、PCNとTroglitazoneでは誘導は見られなかった。今回の結果はCYP3A4の誘導の検討に初代培養マーモセット肝細胞が有用であることを示した。
薬物相互作用について
1)ウサギにおいてNifedipine のCmax到達時における血中濃度は、GFJ投与群では非投与群の1.7倍の値を示した。一方、消失相におけるT1/2は投与群、非投与群で大きな差は認められなかった。この結果は、ヒトモデルとしてのウサギの有用性を示している。一方、GFJ投与により腸管のCYP3A4活性は29%に減少した。このことが、Nifedipine の循環血中AUCを上昇させた原因であると推定された。
2)アルブミンや肝可溶性画分を薬物代謝の反応系に添加することの意義を検討したところ、HSAもしくはラット肝可溶性画分を添加すると、TerfenadineおよびDiclofenacのfuは減少し、これに伴なって酵素活性も減弱した。Diclofenacでは、Km,uはラット肝可溶性画分添加の影響を受けなかったが、それ以外ではKm,uが減少し、見かけ上結合している薬物も代謝されることを示した。さらにMiconazole によるCYP2C9の阻害とKetoconazole によるCYP3A4の阻害に及ぼす影響について調べた。蛋白の添加によりそれぞれのfuと阻害能は減少したが、Miconazoleではラット肝可溶性画分を添加した場合に、Ketoconazole ではHSA添加時に、Ki,uが減少し、見かけ上結合している薬物も酵素を阻害することを示した。従来、非結合型の薬物のみが、代謝反応や酵素阻害に利用されると考えられてきたが、非結合型の薬物のみならず、見かけ上、タンパク質に結合した薬物が代謝を受ける場合や酵素を阻害する場合があることが明らかになった。
in vitroからin vivoの予測について
胆汁排泄過程における相互作用の予測方法の確立を目的として、血液側からの肝細胞への取り込みを遊離肝細胞、肝細胞から胆汁への排泄をCMVを用い、それぞれ阻害の程度を評価した。そこから得られたKiを用い、in vivoでの排泄阻害の程度を予測するため、別途in vivoにおいても相互作用のモデルを構築したところ、PBDはMTXの胆汁排泄および肝取り込みを投与量依存的に低下させたことから、モデルの構築が確認された。取り込み側、排泄側の個々の膜透過過程については、in vitroで測定したKiを用い定量的な予測が可能であることが明らかとなった。さらに構成した式を用いることにより、netの胆汁排泄についても相互作用の予測が可能であることが示唆された。構成した式を用いる大きな問題点として、阻害剤の肝臓中非結合型濃度の必要な点が挙げられるが、これはヒトにおいては得るのが困難な情報である。そこで、血漿中の非結合型濃度を用いて予測を行ったところ、このケースでも予測値は実測値に近く、予測の妥当性が示唆された。しかし阻害剤によっては、肝細胞内に能動輸送によって濃縮されている可能性もある。肝細胞内の非結合型濃度の予測には定数倍のマージンをつけることも必要かもしれない。
結論
ハイリスク患者の予測に必要な代謝経路に関与する酵素に関する情報がフッ化ピリミジン系抗がん剤であるtegafurとdoxifluridin、Maxacalcitol, Ebastinについて得られた。また、相互作用予測のための試験系として酵素阻害に関してはウサギ、酵素誘導能にかんしてはマーモセットの有用性が示された。また、サル小腸より新たにCYP4Fサブファミリーに属するP450MI-2を精製した。また、肝トランスポーターレベルでの薬物間相互作用を、血管側膜と胆管側膜とに分けて、個々に検討し予測を試みた。遊離肝細胞およびCMVを用いた検討をin vivoに積み上げることによって、false negativeな予測を避けるという観点からの定量的な予測が可能であることが明らかとなった。
公開日・更新日
公開日
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更新日
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