文献情報
文献番号
200000739A
報告書区分
総括
研究課題名
内分泌かく乱化学物質の発達期中枢神経系障害に関する実験的研究(総括研究報告書)
課題番号
-
研究年度
平成12(2000)年度
研究代表者(所属機関)
畠中 寛(大阪大学蛋白質研究所)
研究分担者(所属機関)
- 畠中寛(大阪大学蛋白質研究所)
- 浅井清文(名古屋市立大学医学部分子医学研究所)
- 渋谷淳(国立医薬品食品衛生研究所)
- 西原真杉(東京大学大学院農学生命科学研究科)
研究区分
厚生科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 生活安全総合研究事業
研究開始年度
平成11(1999)年度
研究終了予定年度
平成13(2001)年度
研究費
40,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
近年、我々の環境中に数多くの内分泌かく乱化学物質(EDCs)が見い出され、生殖機能を含むヒトへの影響が世界的に懸念されている。EDCsの作用にはエストロジェン受容体(ER)を介した機序が考えられており、その微量曝露によっても生体に不可逆的影響を及ぼすことが指摘されている。中枢神経系においても、胎生期より視床下部・辺縁系を中心としてER を含む性ホルモン受容体が分布しており、当然、その一部を構成する生殖機能中枢も影響を受ける可能性がある。特にホルモン依存的に脳の性分化を果たす周産期での曝露影響として、脳の性分化障害に引き続く生後の内分泌機能障害が懸念される。本班研究は、個体レベルでのin vivo評価系と中枢神経系を構成する細胞レベルでのin vitro評価系を適用することにより、EDCsの神経中枢への影響の本態を明らかにすることを目標とする。また、検索化学物質を統一していくつかの代表的な物質について用量反応相関を求めることにより、EDCsの低用量域での生体影響を総合的に判定し、それらのリスク評価に資する。12年度は、11年度に引き続き、エストロジェン化合物を陽性対照とした評価系の確立を継続すると共に、確立できた系ではEDCs候補物質の評価を開始した。
研究方法
In vivo評価研究は脳の性分化過程及び性成熟後の生殖機能に与える影響を主眼として、ラットを用いた視床下部・下垂体軸、生殖器系の機能と形態学的な評価を遂行している。投与実験は、想定されるEDCsのヒトへの曝露形態を考慮して、母動物に混餌で与えて、経胎盤・経乳的に児動物に被検物質を曝露した。児動物について、脳の性分化の臨界時期での視床下部における性分化関連遺伝子ないし、プロモーター領域にエストロジェンに反応する配列を有する遺伝子群の発現解析と、性成熟後での雌動物の性周期回帰パターン、雄の性行動観察、内分泌関連器官の病理組織学的検索を行い、脳の性分化臨界時期と性成熟後の評価パラメーターとの比較を行った。In vitro 評価研究は、血液・脳関門 (B-BB)、グリア及びニューロンに与える影響を検索した。まずB-BB評価系では、昨年度確立した不死化ウシ脳毛細血管内皮細胞(t-BBEC-117)を用いin vitro B-BB modelを作製し、EDCsによる物質透過性への影響を検討した。グリア評価系では、ラット初代培養グリア細胞でのestradiolによる遺伝子発現変化を DNA microarrayにより検討した。ニューロン評価系では、生存、分化、シナプス可塑性の3つに対する影響評価のため、ラット中枢ニューロンと神経幹細胞の培養系を確立し、estradiolの影響について解析を行った。倫理面への配慮として、主な動物投与実験は混餌投与により行い、その屠殺はすべてネンブタール深麻酔下で大動脈からの脱血により行い、動物に与える苦痛は最小限にとどめた。各種初代培養に用いる実験動物は利用規程に従って用い、In vitro B-BBモデル培養系は不死化した細胞を用いたため、倫理面についての問題はない。
結果と考察
Ethinylestradiol (EE)を妊娠ラットに経口投与した結果、新生ラットの体重及び性分化の異常が確認されているが、この様な動物の視床下部ではgranulin遺伝子の発現増加を認め、性成熟後では雌ラットの性周期の回帰パターンの異常と雄ラットの性行動の異常を検出した。いずれも用量依存性で低用量域からの変化であり、EDCsの周産期曝露による内分泌中枢影響の検出指標としての可能性が示された。また、同様のEE周産期曝露を受けた児動物で、性成熟後に卵巣、子宮等の内分
泌関連器官の病理組織学的変化を認めた。これらの動物の脳の性分化臨界期での視床下部性的二型核におけるGABA transporter type-1、bcl-xL、GFAPなどのエストロジェン応答性遺伝子の発現レベルを検索した結果、ニューロン特異的なGABA transporter type-1の発現低下が、性成熟後の内分泌器官障害を予測する良い指標となることが示された。この遺伝子の発現レベルの低下は、ニューロンのアポトーシスの亢進ないしは関与するER subtypeの発現変化のいずれかを示唆している可能性が高く、これらの検索はエストロジェン作用を示すEDCsによる脳性分化障害の直接的な指標になりうると考えられた。本研究での部位特異的な定量的遺伝子発現解析にかかる多大な労力を考慮すると、アポトーシス関連遺伝子産物ないしER subtypeの免疫組織化学的な検出が実際的な方法として考慮すべきであると考えられた。代表的な6種類のEDCs候補物質についても動物実験を行い、特にmethoxychlorの最高用量投与群 (1200 ppm)でEEと同様の内分泌影響が確認された。また、視床下部での新たな性分化関連遺伝子を探索する目的で、DNA microarrayを用いて、新生ラットの雄ないし雌特異的に発現する遺伝子を、それぞれ38個、41個、同定した。In vitro 評価研究のうち、B-BB modelでのEDCsによる物質透過性影響を検討した結果、示唆されているホルモン作用の違いを問わず、estradiolと多くのEDCsでL-glucoseの透過性を抑制することが判明した。但し、4-nonylphenolは透過性を亢進した。この即時的な透過性低下のメカニズムについては今後の検討課題である。グリア評価系では、estradiolによるグリア細胞での遺伝子発現変化を網羅的に検討した結果、myelin basic protein、myelin proteolipid protein、cationic amino acid transporterの強い誘導が見い出され、EDCsの標的遺伝子としての可能性が示された。但し、アストロサイトを主体とする初代培養を用いたにも拘らず、オリゴデンドロサイト特異的な発現が検出されたため、EDCsのスクリーニングには培養系を工夫してオリゴデンドロサイト由来の遺伝子発現を感度よく検出できる系の確立を図る必要があると考えられた。ニューロン評価系では、まず生存作用に対する効果として、estradiolは胎仔期培養海馬ニューロンの血清除去による細胞死を抑制し、その過程でBDNF mRNAの発現が上昇することを見い出した。一方、生後2週齢培養海馬ニューロンでのestradiolによる生存作用下でNGF mRNAの発現増加が観察され、発達段階による応答性の違いを見出した。しかし、これらを評価系としてbisphenol Aと4-nonylphenolについて解析した結果、いずれの神経栄養因子も誘導していない。ニューロンの分化及びシナプス可塑性への影響については、生後2日齢培養海馬ニューロンでestradiolによるグルタミナーゼの発現上昇と神経伝達物質、グルタミン酸の放出促進効果を見出した。更に培養神経幹細胞でestradiolが神経細胞への分化促進効果を持つ可能性を見出し、それぞれEDCsに応用する予定である。
泌関連器官の病理組織学的変化を認めた。これらの動物の脳の性分化臨界期での視床下部性的二型核におけるGABA transporter type-1、bcl-xL、GFAPなどのエストロジェン応答性遺伝子の発現レベルを検索した結果、ニューロン特異的なGABA transporter type-1の発現低下が、性成熟後の内分泌器官障害を予測する良い指標となることが示された。この遺伝子の発現レベルの低下は、ニューロンのアポトーシスの亢進ないしは関与するER subtypeの発現変化のいずれかを示唆している可能性が高く、これらの検索はエストロジェン作用を示すEDCsによる脳性分化障害の直接的な指標になりうると考えられた。本研究での部位特異的な定量的遺伝子発現解析にかかる多大な労力を考慮すると、アポトーシス関連遺伝子産物ないしER subtypeの免疫組織化学的な検出が実際的な方法として考慮すべきであると考えられた。代表的な6種類のEDCs候補物質についても動物実験を行い、特にmethoxychlorの最高用量投与群 (1200 ppm)でEEと同様の内分泌影響が確認された。また、視床下部での新たな性分化関連遺伝子を探索する目的で、DNA microarrayを用いて、新生ラットの雄ないし雌特異的に発現する遺伝子を、それぞれ38個、41個、同定した。In vitro 評価研究のうち、B-BB modelでのEDCsによる物質透過性影響を検討した結果、示唆されているホルモン作用の違いを問わず、estradiolと多くのEDCsでL-glucoseの透過性を抑制することが判明した。但し、4-nonylphenolは透過性を亢進した。この即時的な透過性低下のメカニズムについては今後の検討課題である。グリア評価系では、estradiolによるグリア細胞での遺伝子発現変化を網羅的に検討した結果、myelin basic protein、myelin proteolipid protein、cationic amino acid transporterの強い誘導が見い出され、EDCsの標的遺伝子としての可能性が示された。但し、アストロサイトを主体とする初代培養を用いたにも拘らず、オリゴデンドロサイト特異的な発現が検出されたため、EDCsのスクリーニングには培養系を工夫してオリゴデンドロサイト由来の遺伝子発現を感度よく検出できる系の確立を図る必要があると考えられた。ニューロン評価系では、まず生存作用に対する効果として、estradiolは胎仔期培養海馬ニューロンの血清除去による細胞死を抑制し、その過程でBDNF mRNAの発現が上昇することを見い出した。一方、生後2週齢培養海馬ニューロンでのestradiolによる生存作用下でNGF mRNAの発現増加が観察され、発達段階による応答性の違いを見出した。しかし、これらを評価系としてbisphenol Aと4-nonylphenolについて解析した結果、いずれの神経栄養因子も誘導していない。ニューロンの分化及びシナプス可塑性への影響については、生後2日齢培養海馬ニューロンでestradiolによるグルタミナーゼの発現上昇と神経伝達物質、グルタミン酸の放出促進効果を見出した。更に培養神経幹細胞でestradiolが神経細胞への分化促進効果を持つ可能性を見出し、それぞれEDCsに応用する予定である。
結論
In vivo 評価系では、脳の性分化過程に関与する遺伝子ないしは性分化の結果として発現変動する遺伝子を脳の性分化に対する影響評価指標として盛り込んでいるが、granulinとGABA-transporter type-1の発現変動は、エストロジェン作用による脳の性分化障害の指標として有用であると考えられた。また、エストロジェン作用による性成熟後の影響として性周期の異常が極低用量域から検出できたことは特記すべきことである。In vitro 評価系のうち、in vitro B-BB 評価系においては、estradiol及び各種EDCs候補物質は、即時的に作用してL-glucoseの透過性を低下させることが判明した。グリア評価系においては、発現遺伝子の網羅的解析によりオリゴデンドロサイト特異的な発現遺伝子を検出し、それらがエストロジェン作用の標的遺伝子である可能性が示された。培養中枢ニューロンの検索系では、ラット胎仔及び生後2週齢海馬ニューロンを用いたニューロンの生存に対する評価システムを構築したが、現在のところ、EDCsにより変動が見られる現象は得られておらず再
考の必要があると考えられる。また、分化に対する評価系として、グルタミナーゼ蛋白質の誘導を指標に用いた系、及び神経幹細胞を用いての系を検討中である。現在、in vitro及びin vivo評価研究とも社会的重要性をもとに代表的な化学物質を選定して検索を進めているが、in vivo評価系において、methoxychlorの高用量投与により児動物にEEと同様の内分泌影響が確認されている。
考の必要があると考えられる。また、分化に対する評価系として、グルタミナーゼ蛋白質の誘導を指標に用いた系、及び神経幹細胞を用いての系を検討中である。現在、in vitro及びin vivo評価研究とも社会的重要性をもとに代表的な化学物質を選定して検索を進めているが、in vivo評価系において、methoxychlorの高用量投与により児動物にEEと同様の内分泌影響が確認されている。
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