文献情報
文献番号
200000695A
報告書区分
総括
研究課題名
内分泌かく乱化学物質等、生活環境中化学物質による人の健康影響についての試験法に関する調査研究
課題番号
-
研究年度
平成12(2000)年度
研究代表者(所属機関)
今井 清((財)食品薬品安全センター秦野研究所)
研究分担者(所属機関)
- 井上 達(国立医薬品食品衛生研究所)
- 永井賢司(三菱化学安全科学研究所)
- 武吉正博((財)化学物質評価研究機構)
- 塚田俊彦(国立がんセンター研究所)
- 西原 力(大阪大学)
- 正宗行人(金沢大)
- 大野泰雄(国立医薬品食品衛生研究所)
- 鈴木恵真子((株)イナリサーチ第2研究所)
- 長尾哲二((財)食品薬品安全センター秦野研究所)
- 渡辺敏明(山形大学)
- 江馬 眞(国立医薬品食品衛生研究所)
- 白井智之(名古屋市立大学)
- 広瀬雅雄(国立医薬品食品衛生研究所)
- 吉村慎介((財)食品薬品安全センター秦野研究所)
- 金子豊蔵(国立医薬品食品衛生研究所)
- 板井昭子((株)医薬分子設計研究所)
- 菅野 純(国立医薬品食品衛生研究所)
- 小野 敦(国立医薬品食品衛生研究所)
- 長谷川隆一(国立医薬品食品衛生研究所)
- 中田琴子(国立医薬品食品衛生研究所)
- 関沢 純(国立医薬品食品衛生研究所)
- 長村 義之(東海大学)
研究区分
厚生科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 生活安全総合研究事業
研究開始年度
平成10(1998)年度
研究終了予定年度
平成13(2001)年度
研究費
160,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
本研究は、内分泌かく乱化学物質の諸課題の内、試験法の開発を中心とした研究を推進し、ごく近い将来、国際協調下、国内諸機関の協力のもとでこの課題に則した、各種実験が行われる際に、速やかに適切な体制をとってこれに応じることができるような、国内の技術的な基盤を整える立場から、国内のこの領域での専門的試験研究者が分担して、経済開発協力機構 (OECD)や、米国環境防護庁関係機関 (EPA・ED-STAC)から提案されている諸試験法の試行的実施と必要に応じたそれらの改良、ならびに新規試験法の開発等を総合的に推進することを目的とした。
研究方法
<試験法開発部門>
3年計画で開始した本研究の最終年度にあたる本年度は、1) 試験法開発部門、2) OECD対応等試験法開発部門、3) 新規基盤整備研究部門、4) 内分泌かく乱化学物質の健康影響に関する調査研究部門の4 分野に分けて研究を行った。
<試験法開発部門>
1)試験管内と個体レベルの一般試験の研究として、ラットの前立腺腹葉における細胞動態を指標とした抗アンドロジェン活性評価系を検討するため、アンドロゲン受容体(AR)に対しアンタゴニストである物質および5α-reductase 阻害剤を投与し、同時にtestosterone propionateを皮下投与した。前立腺腹葉細胞を単離し、細胞周期毎のアポトーシス細胞の割合をフローサイトメロリーで解析した。
雄ラットにethinyl estradiolを反復投与し、血清α2u-globulin (AUG)、血清ホルモンおよび生殖腺、付属腺の重量を測定した。性腺刺激ホルモンの影響を調べるために、無処置ラットにLH-RH拮抗剤である Antideを投与し、血清AUGを測定した。 更に、Antideを単回投与した無処置あるいは去勢雄ラットにtestosterone propionateを投与し、AUGの血中濃度を測定した。
哺乳動物培養細胞を用いた、膜受容体を介するシグナル伝達系をかく乱する化学物質検出系の検討として、PC12-VG細胞および3T3NL 細胞を用いて、TCDD、TCDF、Octylphenolおよび緑茶、紅茶、タバコの水抽出物の生物作用を検討した。
酵母Two-Hybrid試験により500種以上の化学物質についてエストロゲン様活性測定結果をまとめて、ロジスティック回帰分析法により構造活性相関を調べたほか Two-Hybrid System に p-53-SV40 large Tを組込み活性阻害試験系の作成を試みた。
リガンドがエストロゲン受容体(ER)と結合するとLXXLL配列を持ったペプチドと結合することを用いて、N末端をビオチンで標識したペプチドを合成し、これとERとの結合がリガンドの存在下で起こるか否かを調べた。
2)薬理代謝研究では、ヒト肝ミクロソームあるいは S-9 mix とインキュベートして生成されたBisphenol Aおよび o-phenylphenolの代謝物を HPLCで分析した。さらに、CYP分子種についてその発現系を調べ、代謝反応を測定すると共にヒト肝ミクロソーム分画とヒトCYP分子種に対する特異的阻害剤をもちいて生成代謝物量の変化を調べた。
雌雄ラットに エストロゲン様物質を投与して、尿中のエストロゲン発がんリスクマーカー15種の E2 代謝物を定量した。
3)生殖・発生に関する研究では、生後5日の雌ラット新生児に内分泌かく乱化学物質を投与して、視床下部神経核 (性的二型核:SDN-POAおよび前腹側脳室周囲核:AVPvN-POA )神経細胞のアポトーシス細胞を定量的に調べた。
ラット胎齢11.5日培養胚の培養液にエストロゲン様物質を添加し、神経細胞及び生殖細胞の増殖、分化におよぼす影響を検討するとともに、神経上皮細胞のアポトーシス、生殖原基における始原生殖細胞の増殖への影響を検討した。
4)生殖機能に関する研究では、Monobutyl phthalateを妊娠ラットおよび偽妊娠ラットに反復投与し、胎児に対する影響を調べた。
5)発がん性試験研究では、ラット中期発がん性試験法を用いてnonylphenol の肝発がんプロモーション作用をGST-P 陽性細胞巣を指標病変として検討した。
卵巣摘出ラットにDHPNでイニシエーション処置をしたのち、エストロゲン様物質を反復投与した。更に、各群の半数の動物にsulfadimethoxineを併用投与し、甲状腺の病理組織学的検査と血中の甲状腺関連ホルモンの測定を行った。
<OECD対応等試験法開発部門>
1)OECDにおける子宮肥大試験およびHershberger 試験
子宮肥大試験においては、nonylphenolを未性成熟ラット、卵巣摘出ラットに反復投与してそれぞれの反応性の相違を比較した。 更に、卵巣摘出マウスにo,p'-DDTおよびmethoxychlorを反復経口投与し、E2と作用を比較した。
Hershberger試験では、精巣摘出ラットにtestosterone propionateを投与し、副生殖器の重量の変化を調べるとともに、この系を用いてbisphenol A の作用を検討した。
2)OECD ガイドライン407 (28日間反復投与毒性試験法) に関する研究として、雌雄ラットに、genisteinを反復投与した。エストロゲン様物質を反復投与し、肝臓および腎臓のα2u-globulin (AUG) の影響を調べた。
<新規基盤整備研究部門>
1)電算検索と評価に関する研究では、コンピュータを用いた理論的な解析と検索を行った。市販データベース(available chemical directory)の中の約20万化学物質を使用し、バーチャルスクリーニングを行い、結合活性確認を行った。また、既知のエストロゲン作用物質については受容体との相互作用様式を推定し、結合自由エネルギーを推算した。
2)3D-QSARに関する実験解析的研究では、ERE固定化センサーチップを作成し、これにエストロゲン様物質をインジェクトして、SPR装置を用い、結合と解離の過程を測定した。更に、それぞれの化合物のER-ERE相互作用におよぼすED50 を求め、コンピュータ計算による推定活性スコアおよびCAT activityと比較した。
3)トキシコゲノミックスに関する研究では、卵巣摘出マウスに17β-estradiolを反復投与して、経時的に子宮重量を測定し、更に、子宮の遺伝子発現をマイクロアレイアッセイでみた。卵巣摘出マウスに17β-estradiolを反復皮下投与あるいは浸透ポンプを埋込み、DNAチップに視床下部から抽出したcDNAをハイブリッドさせて、遺伝子発現パターンを調べた。
<内分泌かく乱化学物質の健康影響に関する調査部門>
1)内分泌かく乱化学物質等の文献情報に関する調査研究では、フタル酸エステルのげっ歯類における生殖・発生毒性について近年の文献を中心に整理した。
2)データベース構築と3次元構造活性相関に関する研究では、内分泌かく乱化学物質と生体系との相互作用実験を相互に参照、比較、分析するための情報のデータベース化の検討およびインターネットから利用できるシステムの構築を検討した。内分泌かく乱化学物質と生体分子の3次元構造に基づいた構造活性相関の研究を種々のプログラムを用いて行った。
3)健康影響に関する情報収集と評価に関する研究では、Internet Greateful Med. のToxlineを使用して大豆エストロゲン物質、有機錫、フタル酸エステルおよびダイオキシン類について、データベース化を試みた。
4)内分泌かく乱化学物質に関する用語集では、「内分泌かく乱化学物質の生物試験研究法」の出版に向けて具体的な作業を開始した。
3年計画で開始した本研究の最終年度にあたる本年度は、1) 試験法開発部門、2) OECD対応等試験法開発部門、3) 新規基盤整備研究部門、4) 内分泌かく乱化学物質の健康影響に関する調査研究部門の4 分野に分けて研究を行った。
<試験法開発部門>
1)試験管内と個体レベルの一般試験の研究として、ラットの前立腺腹葉における細胞動態を指標とした抗アンドロジェン活性評価系を検討するため、アンドロゲン受容体(AR)に対しアンタゴニストである物質および5α-reductase 阻害剤を投与し、同時にtestosterone propionateを皮下投与した。前立腺腹葉細胞を単離し、細胞周期毎のアポトーシス細胞の割合をフローサイトメロリーで解析した。
雄ラットにethinyl estradiolを反復投与し、血清α2u-globulin (AUG)、血清ホルモンおよび生殖腺、付属腺の重量を測定した。性腺刺激ホルモンの影響を調べるために、無処置ラットにLH-RH拮抗剤である Antideを投与し、血清AUGを測定した。 更に、Antideを単回投与した無処置あるいは去勢雄ラットにtestosterone propionateを投与し、AUGの血中濃度を測定した。
哺乳動物培養細胞を用いた、膜受容体を介するシグナル伝達系をかく乱する化学物質検出系の検討として、PC12-VG細胞および3T3NL 細胞を用いて、TCDD、TCDF、Octylphenolおよび緑茶、紅茶、タバコの水抽出物の生物作用を検討した。
酵母Two-Hybrid試験により500種以上の化学物質についてエストロゲン様活性測定結果をまとめて、ロジスティック回帰分析法により構造活性相関を調べたほか Two-Hybrid System に p-53-SV40 large Tを組込み活性阻害試験系の作成を試みた。
リガンドがエストロゲン受容体(ER)と結合するとLXXLL配列を持ったペプチドと結合することを用いて、N末端をビオチンで標識したペプチドを合成し、これとERとの結合がリガンドの存在下で起こるか否かを調べた。
2)薬理代謝研究では、ヒト肝ミクロソームあるいは S-9 mix とインキュベートして生成されたBisphenol Aおよび o-phenylphenolの代謝物を HPLCで分析した。さらに、CYP分子種についてその発現系を調べ、代謝反応を測定すると共にヒト肝ミクロソーム分画とヒトCYP分子種に対する特異的阻害剤をもちいて生成代謝物量の変化を調べた。
雌雄ラットに エストロゲン様物質を投与して、尿中のエストロゲン発がんリスクマーカー15種の E2 代謝物を定量した。
3)生殖・発生に関する研究では、生後5日の雌ラット新生児に内分泌かく乱化学物質を投与して、視床下部神経核 (性的二型核:SDN-POAおよび前腹側脳室周囲核:AVPvN-POA )神経細胞のアポトーシス細胞を定量的に調べた。
ラット胎齢11.5日培養胚の培養液にエストロゲン様物質を添加し、神経細胞及び生殖細胞の増殖、分化におよぼす影響を検討するとともに、神経上皮細胞のアポトーシス、生殖原基における始原生殖細胞の増殖への影響を検討した。
4)生殖機能に関する研究では、Monobutyl phthalateを妊娠ラットおよび偽妊娠ラットに反復投与し、胎児に対する影響を調べた。
5)発がん性試験研究では、ラット中期発がん性試験法を用いてnonylphenol の肝発がんプロモーション作用をGST-P 陽性細胞巣を指標病変として検討した。
卵巣摘出ラットにDHPNでイニシエーション処置をしたのち、エストロゲン様物質を反復投与した。更に、各群の半数の動物にsulfadimethoxineを併用投与し、甲状腺の病理組織学的検査と血中の甲状腺関連ホルモンの測定を行った。
<OECD対応等試験法開発部門>
1)OECDにおける子宮肥大試験およびHershberger 試験
子宮肥大試験においては、nonylphenolを未性成熟ラット、卵巣摘出ラットに反復投与してそれぞれの反応性の相違を比較した。 更に、卵巣摘出マウスにo,p'-DDTおよびmethoxychlorを反復経口投与し、E2と作用を比較した。
Hershberger試験では、精巣摘出ラットにtestosterone propionateを投与し、副生殖器の重量の変化を調べるとともに、この系を用いてbisphenol A の作用を検討した。
2)OECD ガイドライン407 (28日間反復投与毒性試験法) に関する研究として、雌雄ラットに、genisteinを反復投与した。エストロゲン様物質を反復投与し、肝臓および腎臓のα2u-globulin (AUG) の影響を調べた。
<新規基盤整備研究部門>
1)電算検索と評価に関する研究では、コンピュータを用いた理論的な解析と検索を行った。市販データベース(available chemical directory)の中の約20万化学物質を使用し、バーチャルスクリーニングを行い、結合活性確認を行った。また、既知のエストロゲン作用物質については受容体との相互作用様式を推定し、結合自由エネルギーを推算した。
2)3D-QSARに関する実験解析的研究では、ERE固定化センサーチップを作成し、これにエストロゲン様物質をインジェクトして、SPR装置を用い、結合と解離の過程を測定した。更に、それぞれの化合物のER-ERE相互作用におよぼすED50 を求め、コンピュータ計算による推定活性スコアおよびCAT activityと比較した。
3)トキシコゲノミックスに関する研究では、卵巣摘出マウスに17β-estradiolを反復投与して、経時的に子宮重量を測定し、更に、子宮の遺伝子発現をマイクロアレイアッセイでみた。卵巣摘出マウスに17β-estradiolを反復皮下投与あるいは浸透ポンプを埋込み、DNAチップに視床下部から抽出したcDNAをハイブリッドさせて、遺伝子発現パターンを調べた。
<内分泌かく乱化学物質の健康影響に関する調査部門>
1)内分泌かく乱化学物質等の文献情報に関する調査研究では、フタル酸エステルのげっ歯類における生殖・発生毒性について近年の文献を中心に整理した。
2)データベース構築と3次元構造活性相関に関する研究では、内分泌かく乱化学物質と生体系との相互作用実験を相互に参照、比較、分析するための情報のデータベース化の検討およびインターネットから利用できるシステムの構築を検討した。内分泌かく乱化学物質と生体分子の3次元構造に基づいた構造活性相関の研究を種々のプログラムを用いて行った。
3)健康影響に関する情報収集と評価に関する研究では、Internet Greateful Med. のToxlineを使用して大豆エストロゲン物質、有機錫、フタル酸エステルおよびダイオキシン類について、データベース化を試みた。
4)内分泌かく乱化学物質に関する用語集では、「内分泌かく乱化学物質の生物試験研究法」の出版に向けて具体的な作業を開始した。
結果と考察
1)試験管内と個体レベルの一般試験の研究として、いずれの被験物質も前立腺腹葉重量に影響はみられなかったが、細胞周期依存性アポトーシス細胞の増加がみられ、AR antagonistと5α-reductase inhibitorではそのパターンが異なることが分かった。本実験系はアンドロジェン依存性細胞のアポトーシスを指標とした抗アンドロジェン活性評価系として有用であることが示唆された。
雄ラットのAUG の血中濃度は、EEおよびAntide反復投与により低下し、視床下部-下垂体-性腺軸のかく乱に関しても捕らえることが可能と思われた。去勢動物に、TP を投与すると血中AUGの増加がみられた。血清AUGはEndocrine Disrupter検出のための新規生物指標として有用と思われる。
PC12-VGおよび3T3NL細胞に TCDD, TCDF, octylphenolを作用させても、ベータガラクトシダーゼ活性上昇はみられなかった。一方、PC12-VG 細胞に緑茶水抽出物の生物作用を検討した結果、アデノシン様作用を有する物質とこれを抑制する物質が含まれていることが分かり、この検出系は環境中の生物作用を有する物質を簡便に検出できることが明らかとなった。膜受容体を介するシグナル伝達cAMPをセカンドメッセンジャーとするシグナル伝達系の変調を来す物質の検出に利用できると考えられる。
酵母Two-Hybrid試験(ERα系)により534物質中64物質が陽性と評価された。評価結果との構造活性相関はよく一致した。p53系による活性阻害試験系の開発は、安定してガラクトシダーゼを発現する酵母株が得られたことからほぼ満足できる試験系が作製出来たと考えられる。
リガンドがERと結合するとコアクチベータLXXLLが結合することを利用したエストロゲン様作用物質検出試験法ではERαよりも ERβの方が安定した結果を得た。この方法で、エストロゲンニアゴニストの検出のみならず、アンタゴニストも検出できることが示唆された。この試験系では、植物性エストロゲンであるゲニスタインは再現性、感度とも良く検出できることが分かったが、エストロゲンレセプターへの結合力が弱いと思われる物質の検出はあまり良くなかった。
2)薬理代謝研究では、bisphenol Aおよびo-phenylphenolの代謝物をHPLCで分析した結果、bisphenol Aではo-カテコールへの変換は認められず、o-phenylphenolではフェニルヒドロキノン(PHQ)への変換が確認された。o-phenylphenolとPHQとの間にエストロゲン活性の差は見られなかったことから、酸素ラジカルと内分泌かく乱作用との直接的な関連は少ないと考えられた。
エストロゲン代謝物の尿中の発がんリスクマーカーを分析した結果、nonylphenol、bisphenol A、buthyl benzylphtalateのいずれもE2代謝物の尿中排泄量に影響を及ぼし、その挙動はそれぞれ異なった。今後、代謝物が、エストロゲン発がんのリスクマーカーとなる可能性を示唆するものと考えられる。
3)生殖・発生面に関する研究では、生後5日の雌ラットにエストロゲン様物質を投与した結果、AVPvN-POA で神経細胞のアポトーシスが誘発された。一方、estradiol benzoate投与により SDN-PON で細胞死が逆に抑制された。異なったニューロン群の間で内分泌かく乱化学物質に対する遺伝子発現の反応性が異なっている可能性が示唆された。
内分泌かく乱化学物質の培養胚に及ぼす影響の検討では、エストロゲン様物質は神経上皮細胞のアポトーシスの増加を引き起こし、bisphenol Aでは心臓および肝臓にもアポトーシス細胞の増加が認められたが、各物質ともに始原生殖細胞には影響を与えなかった。従って、始原生殖細胞を指標にした内分泌かく乱物質の評価法の開発に関しては、被験物質の暴露時期、胞子体の観察法などさらに検討が必要である。
4)生殖機能に関する研究では、フタル酸エステルの生殖障害に関する研究との一環として、妊娠および偽妊娠ラットにMBnP を反復投与した結果、1000 mg/kg 以上で着床前および着床後の胚の死亡率が有意に上昇し、偽妊娠ラットでは子宮重量が有意に低下した。MBnP 投与による早期胚死亡は、子宮機能の低下、すなわち脱落膜形成の抑制に起因していることが示唆された。
5)発がん性試験研究では、ラット中期発がん性試験法を用いてnonylphenol の肝発がんプロモーション作用を検討した結果、プロモーション作用を示さなかった。
卵巣摘出ラットにDHPNでイニシエーション処置後、エストロゲン様物質を反復投与あるいはsulfadimethoxineを併用投与した結果、estradiol benzoate + sulfadimethoxine投与群に於いてのみ甲状腺腫瘍が発生し, TSH値も上昇した。甲状腺腫瘍の発生には、甲状腺内におけるホルモンの合成阻害に起因したネガティブフィードバック、甲状腺濾胞細胞に対する直接刺激などが複合的に関与している可能性が示唆された。
<OECD対応等試験法開発部門>
1)OECDにおける子宮肥大試験およびHershberger 試験
子宮肥大試験において、未性成熟と卵巣摘出ラットのnonylphenolに対する感受性を比較すると、卵巣摘出ラットの方が感度が良かった。卵巣摘出マウスにo,p'-DDTあるいはmethoxychlorを反復投与した結果、子宮に対するエストロゲン作用は、E2に比しo,p'-DDTは2×10-5倍、methoxychlorは5×10-4倍であった。
Hershberger 試験においては、testosteron propionateは用量に依存して、前立腺腹葉、肛門挙筋、球海綿体筋、亀頭、精嚢、および凝固腺、尿道球腺の重量増加がみられた。Bisphenol Aの投与では、対照群と差がなかった。
2)OECDガイドライン 407 (28日間反復投与毒性試験法) に関する研究では、genistein の28日間反復投与で生殖器に対する影響は認められなかった。一方、methoxychlorは雄ラットの肝臓および腎臓に於いて蛋白質含量、肝臓のAUG の mRNA 発現の抑制が認められたが、nonylphenol投与では変化はみられなかった。
<新規基盤整備研究部門>
1)内分泌かく乱化学物質の電算検索と評価の面では、バーチャルスクリーニングではフェノール系化合物及びアニリン系・ベンズアミド系化合物だけでなく新規のER結合活性化合物が見つかった。これは本コンピュータスクリーニングの有用性を示していることを示唆し、受容体立体構造を利用して化合物の結合様式を推定し、そのときの結合自由エネルギーを推算することで、活性未知化合物の活性値の推定が可能となった。必要とされる時間は1化合物につき数分であり、膨大な数の化合物のスクリーニングにも適している。
2)3D-QSAR に関する実験解析的研究では、ER-ERE相互作用変化の解析により作用未知の化合物による受容体作用の定量的予測が可能であることを示した。このことは、単に化学物質の内分泌作用を予測するものではなく、生体への本質的影響までを予測可能にし、さらに、動物実験などのデータと組み合わせ、得られた情報を計算科学的解析にフィードバックすることで、新規3D-QSARの発展に寄与すると考えられる。
3)トキシコゲノミックスに関する研究では、cDNAマイクロアレイを用いたE2による子宮遺伝子発現変動は、約5000種のうち約250種が変動を示し、さまざまなパターンに分類可能であった。投与方法の違いによる遺伝子発現パターンの相違を調べる研究では、エストロゲンの1日当たりの投与量が同じでも投与法が異なることで子宮肥大及び遺伝子の発現パターンが異なることが分かった。
<内分泌かく乱化学物質の健康影響に関する調査研究部門>
1)内分泌かく乱化学物質等の文献情報に関する調査研究では、フタル酸エステル類は 子宮肥大試験ではエストロゲン様活性がみられず、エストロゲン受容体に結合するための共通の構造を有していない。ラット雄への投与において抗アンドロゲン様作用がみられ、妊娠後半のラットへの投与でアンドロゲン受容体を介さない抗アンドロゲン作用の発現がみられた。この作用は胚致死作用および生殖器官以外の催奇形性作用より低い量で発現することが示されている。これらのことから、一部のフタル酸エステルはげっ歯類において内分泌かく乱作用を示すと判断することができる。
2)データベース構築と3次元構造活性相関に関する研究では、CHARMmによる結合エネルギーの値は、実験値と相関を示さなかった。FMO法の計算結果によるER?-リガンド結合エネルギーと実験値(RBA)との相関係数は高い相関を示した。またER?とER?において、genisteinとラロキシフェンのRBAの順序が逆転することが計算からも示された。フラグメント分子軌道計算法は計算時間がかかるが、精度を上げることができ、内分泌かく乱化学物質のスクリーニングに有用であることが示された。
3)健康影響に関する情報収集と評価に関する研究では、文献検索では、有機錫15件、フタル酸エステル125件、TCDD 486件、大豆エストロゲン117件検索できた。内分泌かく化学物質は、必ずしも受容体経由で影響をおよぼしているものばかりではなく作用メカニズムと定量的なリスクの可能性をあわせて検討し、リスク評価をする必要がある。更に、ヒト以外でみられた影響が、ヒトにあてはまるかについて検討する必要がある。
4)内分泌かく乱化学物質に関する用語集では、「内分泌かく乱化学物質の生物試験研究法」を出版した。これらの資料が今後の内分泌かく乱化学物質の試験研究に大いに寄与するものと思われる。
雄ラットのAUG の血中濃度は、EEおよびAntide反復投与により低下し、視床下部-下垂体-性腺軸のかく乱に関しても捕らえることが可能と思われた。去勢動物に、TP を投与すると血中AUGの増加がみられた。血清AUGはEndocrine Disrupter検出のための新規生物指標として有用と思われる。
PC12-VGおよび3T3NL細胞に TCDD, TCDF, octylphenolを作用させても、ベータガラクトシダーゼ活性上昇はみられなかった。一方、PC12-VG 細胞に緑茶水抽出物の生物作用を検討した結果、アデノシン様作用を有する物質とこれを抑制する物質が含まれていることが分かり、この検出系は環境中の生物作用を有する物質を簡便に検出できることが明らかとなった。膜受容体を介するシグナル伝達cAMPをセカンドメッセンジャーとするシグナル伝達系の変調を来す物質の検出に利用できると考えられる。
酵母Two-Hybrid試験(ERα系)により534物質中64物質が陽性と評価された。評価結果との構造活性相関はよく一致した。p53系による活性阻害試験系の開発は、安定してガラクトシダーゼを発現する酵母株が得られたことからほぼ満足できる試験系が作製出来たと考えられる。
リガンドがERと結合するとコアクチベータLXXLLが結合することを利用したエストロゲン様作用物質検出試験法ではERαよりも ERβの方が安定した結果を得た。この方法で、エストロゲンニアゴニストの検出のみならず、アンタゴニストも検出できることが示唆された。この試験系では、植物性エストロゲンであるゲニスタインは再現性、感度とも良く検出できることが分かったが、エストロゲンレセプターへの結合力が弱いと思われる物質の検出はあまり良くなかった。
2)薬理代謝研究では、bisphenol Aおよびo-phenylphenolの代謝物をHPLCで分析した結果、bisphenol Aではo-カテコールへの変換は認められず、o-phenylphenolではフェニルヒドロキノン(PHQ)への変換が確認された。o-phenylphenolとPHQとの間にエストロゲン活性の差は見られなかったことから、酸素ラジカルと内分泌かく乱作用との直接的な関連は少ないと考えられた。
エストロゲン代謝物の尿中の発がんリスクマーカーを分析した結果、nonylphenol、bisphenol A、buthyl benzylphtalateのいずれもE2代謝物の尿中排泄量に影響を及ぼし、その挙動はそれぞれ異なった。今後、代謝物が、エストロゲン発がんのリスクマーカーとなる可能性を示唆するものと考えられる。
3)生殖・発生面に関する研究では、生後5日の雌ラットにエストロゲン様物質を投与した結果、AVPvN-POA で神経細胞のアポトーシスが誘発された。一方、estradiol benzoate投与により SDN-PON で細胞死が逆に抑制された。異なったニューロン群の間で内分泌かく乱化学物質に対する遺伝子発現の反応性が異なっている可能性が示唆された。
内分泌かく乱化学物質の培養胚に及ぼす影響の検討では、エストロゲン様物質は神経上皮細胞のアポトーシスの増加を引き起こし、bisphenol Aでは心臓および肝臓にもアポトーシス細胞の増加が認められたが、各物質ともに始原生殖細胞には影響を与えなかった。従って、始原生殖細胞を指標にした内分泌かく乱物質の評価法の開発に関しては、被験物質の暴露時期、胞子体の観察法などさらに検討が必要である。
4)生殖機能に関する研究では、フタル酸エステルの生殖障害に関する研究との一環として、妊娠および偽妊娠ラットにMBnP を反復投与した結果、1000 mg/kg 以上で着床前および着床後の胚の死亡率が有意に上昇し、偽妊娠ラットでは子宮重量が有意に低下した。MBnP 投与による早期胚死亡は、子宮機能の低下、すなわち脱落膜形成の抑制に起因していることが示唆された。
5)発がん性試験研究では、ラット中期発がん性試験法を用いてnonylphenol の肝発がんプロモーション作用を検討した結果、プロモーション作用を示さなかった。
卵巣摘出ラットにDHPNでイニシエーション処置後、エストロゲン様物質を反復投与あるいはsulfadimethoxineを併用投与した結果、estradiol benzoate + sulfadimethoxine投与群に於いてのみ甲状腺腫瘍が発生し, TSH値も上昇した。甲状腺腫瘍の発生には、甲状腺内におけるホルモンの合成阻害に起因したネガティブフィードバック、甲状腺濾胞細胞に対する直接刺激などが複合的に関与している可能性が示唆された。
<OECD対応等試験法開発部門>
1)OECDにおける子宮肥大試験およびHershberger 試験
子宮肥大試験において、未性成熟と卵巣摘出ラットのnonylphenolに対する感受性を比較すると、卵巣摘出ラットの方が感度が良かった。卵巣摘出マウスにo,p'-DDTあるいはmethoxychlorを反復投与した結果、子宮に対するエストロゲン作用は、E2に比しo,p'-DDTは2×10-5倍、methoxychlorは5×10-4倍であった。
Hershberger 試験においては、testosteron propionateは用量に依存して、前立腺腹葉、肛門挙筋、球海綿体筋、亀頭、精嚢、および凝固腺、尿道球腺の重量増加がみられた。Bisphenol Aの投与では、対照群と差がなかった。
2)OECDガイドライン 407 (28日間反復投与毒性試験法) に関する研究では、genistein の28日間反復投与で生殖器に対する影響は認められなかった。一方、methoxychlorは雄ラットの肝臓および腎臓に於いて蛋白質含量、肝臓のAUG の mRNA 発現の抑制が認められたが、nonylphenol投与では変化はみられなかった。
<新規基盤整備研究部門>
1)内分泌かく乱化学物質の電算検索と評価の面では、バーチャルスクリーニングではフェノール系化合物及びアニリン系・ベンズアミド系化合物だけでなく新規のER結合活性化合物が見つかった。これは本コンピュータスクリーニングの有用性を示していることを示唆し、受容体立体構造を利用して化合物の結合様式を推定し、そのときの結合自由エネルギーを推算することで、活性未知化合物の活性値の推定が可能となった。必要とされる時間は1化合物につき数分であり、膨大な数の化合物のスクリーニングにも適している。
2)3D-QSAR に関する実験解析的研究では、ER-ERE相互作用変化の解析により作用未知の化合物による受容体作用の定量的予測が可能であることを示した。このことは、単に化学物質の内分泌作用を予測するものではなく、生体への本質的影響までを予測可能にし、さらに、動物実験などのデータと組み合わせ、得られた情報を計算科学的解析にフィードバックすることで、新規3D-QSARの発展に寄与すると考えられる。
3)トキシコゲノミックスに関する研究では、cDNAマイクロアレイを用いたE2による子宮遺伝子発現変動は、約5000種のうち約250種が変動を示し、さまざまなパターンに分類可能であった。投与方法の違いによる遺伝子発現パターンの相違を調べる研究では、エストロゲンの1日当たりの投与量が同じでも投与法が異なることで子宮肥大及び遺伝子の発現パターンが異なることが分かった。
<内分泌かく乱化学物質の健康影響に関する調査研究部門>
1)内分泌かく乱化学物質等の文献情報に関する調査研究では、フタル酸エステル類は 子宮肥大試験ではエストロゲン様活性がみられず、エストロゲン受容体に結合するための共通の構造を有していない。ラット雄への投与において抗アンドロゲン様作用がみられ、妊娠後半のラットへの投与でアンドロゲン受容体を介さない抗アンドロゲン作用の発現がみられた。この作用は胚致死作用および生殖器官以外の催奇形性作用より低い量で発現することが示されている。これらのことから、一部のフタル酸エステルはげっ歯類において内分泌かく乱作用を示すと判断することができる。
2)データベース構築と3次元構造活性相関に関する研究では、CHARMmによる結合エネルギーの値は、実験値と相関を示さなかった。FMO法の計算結果によるER?-リガンド結合エネルギーと実験値(RBA)との相関係数は高い相関を示した。またER?とER?において、genisteinとラロキシフェンのRBAの順序が逆転することが計算からも示された。フラグメント分子軌道計算法は計算時間がかかるが、精度を上げることができ、内分泌かく乱化学物質のスクリーニングに有用であることが示された。
3)健康影響に関する情報収集と評価に関する研究では、文献検索では、有機錫15件、フタル酸エステル125件、TCDD 486件、大豆エストロゲン117件検索できた。内分泌かく化学物質は、必ずしも受容体経由で影響をおよぼしているものばかりではなく作用メカニズムと定量的なリスクの可能性をあわせて検討し、リスク評価をする必要がある。更に、ヒト以外でみられた影響が、ヒトにあてはまるかについて検討する必要がある。
4)内分泌かく乱化学物質に関する用語集では、「内分泌かく乱化学物質の生物試験研究法」を出版した。これらの資料が今後の内分泌かく乱化学物質の試験研究に大いに寄与するものと思われる。
結論
本研究により、細胞膜表面の受容体を介した内分泌かく乱作用の検出のための試験法や生体内の反応をより正確に反映した簡便な試験管内試験法の開発の基礎となる情報を得ることが出来た。さらに、新たな試験法の開発に繋がる胎児、新生児の分化・発達あるいは発癌に及ぼす内分泌かく乱化学物質の影響の一部が明確にされた。また、国際協力の一環として、OECDプレバリデーション・バリデーション試験を実施し、示唆に富む情報を提供することが出来た。加えて、内分泌かく乱化学物質の健康影響に関する情報の調査研究成果を基にデータベースを作成し、その一部をインターネットから利用できるシステムを開発するとともに、内分泌かく乱化学物質に関する用語集の作成のための執筆・編集活動を開始した。
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