文献情報
文献番号
200000662A
報告書区分
総括
研究課題名
進行性腎障害に対する進展の抑制に関する研究
課題番号
-
研究年度
平成12(2000)年度
研究代表者(所属機関)
林 松彦(慶應義塾大学医学部)
研究分担者(所属機関)
- 猿田享男(慶應義塾大学医学部)
- 福田恵一(慶應義塾大学医学部)
- 佐々木 成(東京医科歯科大学医学部)
- 川村哲也(東京慈恵医科大学)
研究区分
厚生科学研究費補助金 先端的厚生科学研究分野 特定疾患対策研究事業
研究開始年度
平成12(2000)年度
研究終了予定年度
平成13(2001)年度
研究費
20,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
進行性腎障害から末期腎不全にいたる患者数は増加傾向にあり、その治療法としては、原疾患の根治と廃絶した腎機能の再生が最善であるが、今日まで実用化されていない。本研究では、これらの問題を踏まえて、腎臓の再生の可能性を検討し、実用化をはかるために立案された。
研究方法
腎機能再生のために、単離β間在細胞、尿中細胞、間葉系幹細胞を原基として、尿細管細胞、糸球体構成細胞を誘導するために、種々の成長因子とともに、培養を行った。また、尿細管細胞のin situでの再生、硬化進展抑制のために、アデノウィルスをベクターとして、NFκBを阻害するような、変異IκBの尿細管局所での発現の影響を、アルブミン負荷蛋白尿モデルラットで検討した。in vivoで、末梢血中に投与した骨髄細胞が、腎臓構成細胞に分化しうるかについて、以下の方法を用いて検討した。recipientを通常のC57BL/6マウスとし、donorをgreen fluorescent protein(GFP)トランスジェニックマウスとして、これから採取した骨髄細胞をrecipientに移植した後、移植細胞の存在部位をGFPを指標として観察した。雄マウス(DBA/2j)の骨髄を採取し, IL-1 receptor antagonist(IL-1Ra)およびmock遺伝子をレトロウイルスを用いて発現した。このIL-1Ra, GC産生骨髄細胞を、放射線照射した雌マウスに移植し、これらのキメラマウスに抗糸球体基底膜抗体誘導腎炎を惹起させた後、腎機能と腎組織の変化を経時的に評価した。骨髄細胞から、種々の臓器の原基となる細胞を採取する目的で、本年度は心筋細胞株樹立を試みた。C3H/He マウス大腿骨より骨髄を摘出し、Dexter法により3ヶ月以上の長期間培養を行った。長期培養後、不死化した細胞による多クローンの細胞株を作成し、この多クローンの細胞株に対し、DNA脱メチル化剤5-azacytidineにより分化誘導を行った。分化誘導後およそ4週間培養し、数百以上のクローンの中から自己拍動を行う細胞を含むクローンをスクリーニングし、自己拍動する割合の高いクローンを最終的にCMG細胞(Cardiomyogenesisより命名)株として樹立した。CMG細胞は凍結融解を繰り返しても表現形は変わらず、分化誘導後自己拍動を開始する比率はおよそ30%であった。このCMG細胞に対し、免疫染色、Northern Blot、RT-PCRによる心筋特異的遺伝子発現を検討した。尿細管細胞の再生と増殖誘導を引き起こす遺伝子の同定と、それらの遺伝子の機能的な意義、および、急性尿細管障害での発現についても検討を加えた。胎生期にのみ腎に発現し、尿細管細胞の発生、分化に関与するWnt4と、尿細管細胞の細胞増殖に関与する転写因子E2F1に注目した。
結果と考察
単離β間在細胞、尿中細胞、骨髄由来間葉系幹細胞を種々の成長因子とともに培養し、糸球体構成成分の特異的蛋白の発現を検討したが、本年度行った検討ではいずれも陰性であった。一方、細胞の形態が神経細胞様であることから、神経細胞の指標である特異蛋白の発現を検討したところ、これらの培養細胞では、神経細胞特異蛋白発現が証明された。この神経細胞様細胞はカテコールアミン産生酵素の発現は見られなかったが、特定の遺伝子導入を行った後、中枢神経系に移植することにより神経疾患の治療に応用可能であることが示唆された。一方、間質障害を生じ、臨床例での蛋白尿を伴う進行性腎障害と類似した病理変化を示す、アルブミン負荷蛋白尿モデルラットを用いて近位尿細管の障害抑制を試みた。IL-1などのcytokineの情報伝達物質であるNFκB活性化を阻害する変異IκBを組み込んだアデノウィルスを腎動脈に投与したところ、アデノウィル
ス由来の遺伝子発現は近位尿細管に限局し、さらにアルブミン負荷による間質障害を完全に予防した。この結果は、進行性腎障害に重要な役割を果たす、間質障害進行抑制、さらにその改善に応用可能であり、今後腎炎モデルでの有用性を確認する。骨髄移植の実験では、骨髄移植後、糸球体内に時間経過とともにGFP 陽性細胞が出現し、漸増した。骨髄移植6ヶ月後において、共焦点レーザー顕微鏡を用い観察した結果、GFP陽性細胞の一部が糸球体メサンギウム領域にあることが判明した。この組織の2重染色をしたところdesmin陽性細胞の一部にGFP陽性細胞が認められ、糸球体内GFP陽性細胞がメサンギウム細胞である可能性が示唆された。骨髄を抗炎症性サイトカインであるIL-1Raを持続分泌するように改変したIL-1Ra キメラはMock キメラに比し腎炎誘導28日後のBUN, クレアチニンの上昇が有意に抑制された。さらに組織学的検討でも腎炎誘導による糸球体障害が有意に抑制された。以上の結果は、これまでの治療法では根治が不可能とされている急性、慢性腎炎および腎不全に陥った患者の抜本的治療として、患者骨髄をベクターとする遺伝子治療へ道を開くものと考えられた。骨髄間質細胞からの幹細胞系列化の実験において、骨髄細胞は、分化誘導前には線維芽細胞様の形態を呈した。分化誘導後に、ごく少数の細胞が自己拍動を開始し、このクローンを単離し、CMG細胞とした。CMG細胞におけるカテコラミン受容体の発現をRT-PCR法により解析するとα1受容体、β受容体の両者が心筋細胞に分化誘導された後に発現した。心筋細胞特異的に発現するミオシン軽鎖-2v遺伝子のプロモーターにEnhanced Green Fluorescent Protein (GFP)-cDNA遺伝子を組み替えたプラスミドを作製し、CMG細胞に遺伝子導入した。この細胞に5-azacytidineにより最終分化誘導を行い、GFP発現細胞のみを採取し、移植したところ、これらの心筋細胞はレシピエントの心臓で生着し、同期して収縮していた。移植心筋細胞は少なくとも2カ月以上、レシピエント心で生着することが確認された。以上の検討より、骨髄由来の細胞から、機能細胞を継代化することが可能であることが証明され、腎機能再生に応用可能であることが期待される。尿細管細胞の再生と増殖誘導を引き起こす遺伝子の同定を行うため、近位尿細管細胞の再生、分裂、増殖を認める急性腎不全モデルを用いた。ラットの虚血性急性腎不全モデルの再生、増殖の時期に、Wnt4とE2F1が近位尿細管で劇的に発現亢進することを確認した。Wnt4は、受容体結合後beta-cateninを介して細胞増殖、分化を引き起こすことが知られているが、Wnt4遺伝子をLLC-PK1細胞に導入し、さらにbeta-catenin、 転写因子TCFの遺伝子を導入した。これらの遺伝子導入下で、相加的に細胞増殖能がLLC-PK1細胞で亢進した。細胞増殖の重要な因子 であるE2F1をアデノウイルスに組み込み、急性腎不全ラットの腎に発現させると尿細管細胞の増殖が早まり、腎機能は改善した。以上より、Wnt4の遺伝子導入により、尿細管細胞は再生、分裂能を獲得し、尿細管細胞幹細胞の性格を獲得しうる可能性が示唆された。また、E2F1の発現を亢進させるとARF後の腎機能回復は促進されることから、E2F1の発現が尿細管細胞の再生、増殖のkey factor であると考えられた。
ス由来の遺伝子発現は近位尿細管に限局し、さらにアルブミン負荷による間質障害を完全に予防した。この結果は、進行性腎障害に重要な役割を果たす、間質障害進行抑制、さらにその改善に応用可能であり、今後腎炎モデルでの有用性を確認する。骨髄移植の実験では、骨髄移植後、糸球体内に時間経過とともにGFP 陽性細胞が出現し、漸増した。骨髄移植6ヶ月後において、共焦点レーザー顕微鏡を用い観察した結果、GFP陽性細胞の一部が糸球体メサンギウム領域にあることが判明した。この組織の2重染色をしたところdesmin陽性細胞の一部にGFP陽性細胞が認められ、糸球体内GFP陽性細胞がメサンギウム細胞である可能性が示唆された。骨髄を抗炎症性サイトカインであるIL-1Raを持続分泌するように改変したIL-1Ra キメラはMock キメラに比し腎炎誘導28日後のBUN, クレアチニンの上昇が有意に抑制された。さらに組織学的検討でも腎炎誘導による糸球体障害が有意に抑制された。以上の結果は、これまでの治療法では根治が不可能とされている急性、慢性腎炎および腎不全に陥った患者の抜本的治療として、患者骨髄をベクターとする遺伝子治療へ道を開くものと考えられた。骨髄間質細胞からの幹細胞系列化の実験において、骨髄細胞は、分化誘導前には線維芽細胞様の形態を呈した。分化誘導後に、ごく少数の細胞が自己拍動を開始し、このクローンを単離し、CMG細胞とした。CMG細胞におけるカテコラミン受容体の発現をRT-PCR法により解析するとα1受容体、β受容体の両者が心筋細胞に分化誘導された後に発現した。心筋細胞特異的に発現するミオシン軽鎖-2v遺伝子のプロモーターにEnhanced Green Fluorescent Protein (GFP)-cDNA遺伝子を組み替えたプラスミドを作製し、CMG細胞に遺伝子導入した。この細胞に5-azacytidineにより最終分化誘導を行い、GFP発現細胞のみを採取し、移植したところ、これらの心筋細胞はレシピエントの心臓で生着し、同期して収縮していた。移植心筋細胞は少なくとも2カ月以上、レシピエント心で生着することが確認された。以上の検討より、骨髄由来の細胞から、機能細胞を継代化することが可能であることが証明され、腎機能再生に応用可能であることが期待される。尿細管細胞の再生と増殖誘導を引き起こす遺伝子の同定を行うため、近位尿細管細胞の再生、分裂、増殖を認める急性腎不全モデルを用いた。ラットの虚血性急性腎不全モデルの再生、増殖の時期に、Wnt4とE2F1が近位尿細管で劇的に発現亢進することを確認した。Wnt4は、受容体結合後beta-cateninを介して細胞増殖、分化を引き起こすことが知られているが、Wnt4遺伝子をLLC-PK1細胞に導入し、さらにbeta-catenin、 転写因子TCFの遺伝子を導入した。これらの遺伝子導入下で、相加的に細胞増殖能がLLC-PK1細胞で亢進した。細胞増殖の重要な因子 であるE2F1をアデノウイルスに組み込み、急性腎不全ラットの腎に発現させると尿細管細胞の増殖が早まり、腎機能は改善した。以上より、Wnt4の遺伝子導入により、尿細管細胞は再生、分裂能を獲得し、尿細管細胞幹細胞の性格を獲得しうる可能性が示唆された。また、E2F1の発現を亢進させるとARF後の腎機能回復は促進されることから、E2F1の発現が尿細管細胞の再生、増殖のkey factor であると考えられた。
結論
骨髄細胞を出発点として、機能細胞の幹細胞を継代化しうることが証明された。腎細胞に関しては、現在、糸球体構成細胞、尿細管幹細胞の分化誘導には成功していないが、細胞の再生、増殖に関与する因子の解明は進行しており、これらの細胞を骨髄由来間葉系幹細胞から誘導するための知見は蓄積しつつある。また、アデノウィルスを用いた遺伝子導入により、in situで間質硬化の改善、進行抑制が可能であることが示され、進行性腎障害の治療開発に有用な知見を与えた。さらに、骨髄移植により糸球体領域に生着し、メサンギウム細胞への分化を示す細胞が確認され、再生治療への第一歩となる知見といえる。
公開日・更新日
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