文献情報
文献番号
200000466A
報告書区分
総括
研究課題名
アルツハイマー病の神経変性マーカー蛋白質に関する研究(総括研究報告書)
課題番号
-
研究年度
平成12(2000)年度
研究代表者(所属機関)
吉川 和明(大阪大学蛋白質研究所)
研究分担者(所属機関)
- 新延道夫(大阪大学蛋白質研究所)
- 植月太一(大阪大学蛋白質研究所)
- 谷浦秀夫(大阪大学蛋白質研究所)
- 林要喜知(旭川医科大学)
研究区分
厚生科学研究費補助金 先端的厚生科学研究分野 脳科学研究事業
研究開始年度
平成10(1998)年度
研究終了予定年度
平成12(2000)年度
研究費
10,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
アルツハイマー病は大脳新皮質(連合野)や海馬などのニューロンが大量に変性することによって起こる疾患であるが、その原因についてはほとんど明らかにはなっていない。したがって、アルツハイマー病の予防や治療の根拠となる病因の分子機構の解明が急務となっている。現在、アルツハイマー病の確定診断には死後脳の病理像、すなわちニューロン脱落、神経原線維変化、老人斑などがそのマーカーとなっている。しかし、これらの変化はアルツハイマー病の終末像である可能性が高い。したがって、アルツハイマー病脳で変性脱落するニューロン内部で起こっている病的変化を反映するマーカーがあれば、アルツハイマー病の病因解明に有効である。APPは大脳新皮質(連合野)や海馬の錐体細胞などのアルツハイマー病で侵される大型ニューロンに豊富に存在すること、また、アルツハイマー病脳における変性ニューロン内にAPP断片が蓄積されていることが報告されている。さらに、APPはニューロンの種々の病態で発現が上昇し、ニューロン内に蓄積することが知られている。一方、細胞死の遂行にはプロテアーゼであるカスパーゼ群が重要な役割を果たすことが知られているが、アルツハイマー病の脳でもカスパーゼ3陽性の変性ニューロンが見られることが報告されている。そこで本研究では、アルツハイマー病におけるAPPの蓄積やカスパーゼによるAPPの中間代謝産物がニューロン死のマーカーとなり得るかを検討する。
研究方法
ニューロンにアポトーシスを起こす抗APP抗体22C11によって認識される細胞外ドメインに結合する蛋白質の探索は、マウス脳P2/P3画分の高塩濃度抽出液をビオチン化22C11ペプチドを混合後、アビジンアガロースに結合させ1mMのペプチドを用いて溶出することによって行った。10% SDS-PAGE分離後の蛋白質はPVDF膜に転写した後にCBB染色し、気相式シークエンサーによって行った。野生型あるいは変異型APPを発現のための遺伝子導入はアデノウイルスベクターによって行った。カスパーゼ3の活性測定は蛍光基質 Z-DEVD-AFCの切断を指標にした。また、アデノウイルス感染と同時に種々の薬物や酵素活性 阻害剤 を培養液中に添加し,アポトーシスに及ぼす影響を検討した.細胞死の判定は、エチジウムホモダイマーの死細胞核内の取り込み、または核をヘキスト33342で染色することで行った。カルシウムイオンのニューロン内取り込みは放射性標識したカルシウムイオン添加48時間後にアデノウイルスを感染させ,その24時間後に細胞内放射活性を測定した。同様にアデノウイルスベクターを用いてE2F1をヒトニューロンに導入した。また、E2F1誘導後の細胞核をアポトーシス関連蛋白質に対する抗体と抗E2F1抗体で二重染色した後、共焦点レーザー走査顕微鏡により観察した。ラット胎児海馬ニューロンの初代培養はウイスターラット胎仔から海馬領域を取り出し分散状態で1～2ヶ月間ほど培養を継続した。初代培養ニューロンにアデノウイルスベクターを用いてAPPまたはその変異体を感染させた。アストロサイトとニューロンの併置培養には、初代培養大脳由来のアストロサイトの2～3代培養細胞を用いた。インターロイキン8(IL-8)の蛋白質定量は、EILSA法によって行った
結果と考察
APPのN末端領域に対するモノクローン抗体22C11が認識する領域に結合する蛋白質を探索した。ビオチン化した22C11ペプチドをリガンドとしてP2/P3高塩濃度抽出液中に存在する結合蛋白質をアビジン-ビオチンの特異的結合を利用することにより分析した。その結果、1mMのペプチドにより溶出される複数
の蛋白バンドの存在が認められたので、分離能の高い条件下でSDS-PAGEを行い、PVDF膜に転写後、目的とする蛋白バンドのN末端アミノ酸配列を気相式シークエンサーにより決定した。その結果、線虫由来のセリン・スレオニンキナーゼと類似する蛋白質であることが判明した。この蛋白質は22C11認識ペプチドの内在性リガンドとして、APPのアポトーシス誘導に関係している可能性がある。野生型APPをニューロンに過剰発現するとカスパーゼ3の活性化とアポトーシスが起こるが,Aβドメインの一部を欠失した変異型APPを発現したニューロンではみられなかった.また,野生型APP発現ニューロンでは,カスパーゼ3の活性化がピークとなる以前に細胞内カルシウム濃度が上昇していることが明らかになり,さらにカルシウム依存性プロテアーゼとして知られるカルパインの阻害剤によってカスパーゼ3の活性化が抑制された.したがって、カルパインがAPPによるニューロン死を媒介する可能性がある。E2F1はニューロンのアポトーシスの際に上昇することが知られているが、E2F1を発現するアデノウイルスベクターを感染させるとニューロンはアポトーシスを起こした。この際にカスパーゼ3の活性化が見られ、E2F1が核内に斑点状に集積する像が見られた。また、E2F1によってアポトーシスに関連したBaxやBcl-2が誘導されることが見いだされた。野生型APPや細胞質ドメイン(C31)を欠いたAPP変異体cDNAはラット脳海馬由来初代培養ニューロンの死を誘導したが、Aβ領域を欠いた変異体cDNA(ΔAβ)の遺伝子発現では起こらなかった。一方、ワートマニンでAPP代謝産物の細胞外分泌を抑制すると、APPによるニューロン死は増強された。また、APPとAβは相乗的にニューロン死を増強した。APP遺伝子導入によりグリア細胞ではIL-8生産が誘導された。IL-8はAPPを高発現するニューロンに対してのみ、強い細胞障害作用を示した。
の蛋白バンドの存在が認められたので、分離能の高い条件下でSDS-PAGEを行い、PVDF膜に転写後、目的とする蛋白バンドのN末端アミノ酸配列を気相式シークエンサーにより決定した。その結果、線虫由来のセリン・スレオニンキナーゼと類似する蛋白質であることが判明した。この蛋白質は22C11認識ペプチドの内在性リガンドとして、APPのアポトーシス誘導に関係している可能性がある。野生型APPをニューロンに過剰発現するとカスパーゼ3の活性化とアポトーシスが起こるが,Aβドメインの一部を欠失した変異型APPを発現したニューロンではみられなかった.また,野生型APP発現ニューロンでは,カスパーゼ3の活性化がピークとなる以前に細胞内カルシウム濃度が上昇していることが明らかになり,さらにカルシウム依存性プロテアーゼとして知られるカルパインの阻害剤によってカスパーゼ3の活性化が抑制された.したがって、カルパインがAPPによるニューロン死を媒介する可能性がある。E2F1はニューロンのアポトーシスの際に上昇することが知られているが、E2F1を発現するアデノウイルスベクターを感染させるとニューロンはアポトーシスを起こした。この際にカスパーゼ3の活性化が見られ、E2F1が核内に斑点状に集積する像が見られた。また、E2F1によってアポトーシスに関連したBaxやBcl-2が誘導されることが見いだされた。野生型APPや細胞質ドメイン(C31)を欠いたAPP変異体cDNAはラット脳海馬由来初代培養ニューロンの死を誘導したが、Aβ領域を欠いた変異体cDNA(ΔAβ)の遺伝子発現では起こらなかった。一方、ワートマニンでAPP代謝産物の細胞外分泌を抑制すると、APPによるニューロン死は増強された。また、APPとAβは相乗的にニューロン死を増強した。APP遺伝子導入によりグリア細胞ではIL-8生産が誘導された。IL-8はAPPを高発現するニューロンに対してのみ、強い細胞障害作用を示した。
結論
APPの細胞外ドメインを認識しニューロンのアポトーシスを起こす抗体である22C11認識ペプチドへの結合蛋白質として、線虫由来セリン・スレオニンキナーゼ様蛋白質に類似する蛋白質が見出された。この蛋白質はAPP695のアポトーシスシグナル伝達に関与している可能性も考えられる。また。ヒトAPPのAβ領域がアポトーシス誘導に重要な領域であることが明らかとなった。野生型APP導入後のニューロンでは細胞内カルシウムの上昇が観察され、カルパイン阻害剤によってAPPによるカスパーゼ3活性化が阻害された。したがって、APPによるカスパーゼ3の活性化にはカルシウ依存的なカルパインが関わることが示唆された。E2F1をヒト分化ニューロンに導入したところ、カスパーゼ3の活性化を伴った典型的なアポトーシスを起こした。また、E2F1によってアポトーシス関連蛋白質であるBax、Bcl-2が誘導され、ニューロン死への関与が示唆された。初代培養ラット海馬ニューロンはAPP導入すると死滅したが、それは細胞内に蓄積したAβやAPP代謝産物によるものと推定された。一方、APPはアストロサイトのIL-8の産生を高めた。アデノウイルスを用いた本遺伝子導入細胞系は、ADの病因に関わる分子群を探索するために有用なモデル系となることが明らかになった。
公開日・更新日
公開日
-
更新日
-