文献情報
文献番号
199900692A
報告書区分
総括
研究課題名
内分泌かく乱物質に対する感受性の動物種差の解明:チトクロームP450発現を指標として(総括研究報告書)
課題番号
-
研究年度
平成11(1999)年度
研究代表者(所属機関)
出川 雅邦(静岡県立大学)
研究分担者(所属機関)
- 木村良平(静岡県立大学)
- 根本清光(静岡県立大学)
- 梅原 薫(静岡県立大学)
- 横井 毅(金沢大学)
- 藤井宏融(呉大学)
研究区分
厚生科学研究費補助金 健康安全確保総合研究分野 生活安全総合研究事業
研究開始年度
平成11(1999)年度
研究終了予定年度
平成13(2001)年度
研究費
30,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
これまでに、ステロイドホルモンの代謝(合成・分解)や内分泌かく乱物質などの外来化合物の代謝にはチトクロームP450(P450と略す)を中心とした薬物代謝酵素が関わっていること、また、 P450をはじめとする薬物代謝酵素は、しばしば外来化合物の曝露で変動することやこの変動にはしばしば動物種差が見られること、さらにまた、TCDDやPCBなどの代表的な内分泌かく乱物質には、P450をはじめとする薬物代謝酵素を変動させる働きがあることなどが明らかにされている。したがって、内分泌かく乱物質によるP450分子種の変動と内分泌かく乱作用発現との関連性を把握できれば、P450発現に関わる種々の細胞内因子を指標として、ヒトを含めた各動物種に対する危険性を的確に評価することが可能になると期待される。しかし、内分泌かく乱物質のP450発現への影響や、その動物種差の解析はほとんど行われていない。そこで、本研究では、内分泌かく乱物質に対する感受性の動物種差を解明する一環として、「内分泌かく乱物質曝露時における種々動物でのP450発現の変動と内分泌かく乱作用との関連性」を追究する。また、これまで、内分泌かく乱物質の検索や同定は、主にエストロゲン様作用を指標に行われてきたが、生体の恒常性維持には、種々のホルモンが関与しており、1)各ホルモンレセプターへの結合能、2)ホルモン感受性培養細胞に対する分化・増殖誘導能、および、3)ホルモン感受性遺伝子の発現などを指標にした検索、さらには、4)P450発現への影響を検索することによって、より広範な内分泌かく乱物質の同定が可能になるとともに、動物種ごとの危険度をより的確に評価できるようになると考える。
研究方法
研究項目別に以下研究方法を記述する。
1)内分泌かく乱物質によるP450分子種発現への影響:動物種差
PCBのメチルスルホン代謝物には、肝臓のグルクロニルトランスフェラーゼ(UGT)1A1や1A6を誘導する作用があること、また、これによりチロキシン(T4)の代謝が亢進され、血中T4濃度が低下することなどをすでに明らかにしてきている。このようにメチルスルホン代謝物に内分泌かく乱作用のあるPCB類では、その代謝パターンやこの代謝に関わる酵素の質的量的相違が、各動物のこれら内分泌かく乱物質に対する感受性の相違を支配する要因になると考えられる。そこで、2,2',4',5,5'-ペンタクロロビフェニール(CB101)および2,2',3',4',5,6-ヘキサクロロビフェニール(CB132)を試料として、ラットとマウスに投与した後の糞中および肝臓中の含硫代謝物量、チトクロームP450(P450 と略す)やUGTなどの薬物代謝酵素活性などそれぞれ測定し、ラットとマウス間におけるそれらの種差を検討した。また、精巣におけるアンドロゲンの合成阻害や肝の増殖作用があることが知られている鉛イオン(硝酸鉛)を試料として、ラットの肝や精巣における薬物代謝酵素 (P450分子種:CYP1A1/2、3A1/3A2など)や ステロイドホルモン合成に関わるP450分子種(CYP51やCYP11)の発現への影響をRT-PCR法を用いて検討した。
2)植物成分からの内分泌かく乱物質の検索
これまで、植物性内分泌かく乱物質としては、ゲニスチン、クメステロールなどの植物性エストロゲン様作用化合物が注目を浴び、多数の化合物が分離・同定されてきている。一方、植物成分にはその他のホルモン様作用化合物の存在が示唆されているが、それらについての詳細な研究は行われていない。そこで、本研究では、糖代謝のみならずストレスや中枢神経系機能の調節に深く関わる副腎皮質ホルモンのグルココルチコイド(GC)に着目し、様々な生薬・植物のエキスの粗画分を出発材料として、GC様作用を有する化合物の検索および同定を以下の2方法を用いて行った。i)培養細胞(M1細胞)の分化誘導を指標とした検索法:GCによりマクロファージに分化誘導されるマウス骨髄性白血病由来M1細胞を用い、分化誘導作用(貪食能の誘導)を指標にした測定およびii)遺伝子プロモーター活性を指標とする検索法:GCに感受性遺伝子プロモーター(マウス乳ガンウイルスLTR由来)をレポーター遺伝子(ルシフェラーゼ)上流に連結した発現プラスミドをラット線維芽細胞3Y1に導入した細胞株を用いた測定。
3)種々P450分子種の発現機構の解明
P450分子種の発現機構の解析には培養細胞を用いることが有利であるが、現在まで種々P450分子種を発現する培養細胞株は樹立されていない。そこで、まず、ラット肝初代培養細胞より樹立した培養肝細胞株を用いて各種P450分子種の発現・誘導能を検討した。また、硝酸鉛処理時のCYP51分子種の発現変動をRT-PCR法を用いて検討した。
4)チトクロームP450誘導を指標とするin vitro毒性評価系の確立
ヒト組み換えP450(CYP1A1/1A2およびCYP1B1)発現系細胞を用いて、内分泌かく乱作用が懸念されているディーゼル排気粉塵抽出物や芳香族ニトロ化合物の代謝活性化およびこれら化合物のP450への影響を、主にumu試験 を用いて検索した。
5)ダイオキシン類のP450酵素による代謝とその種差・性差の解析
2,3,7,8-テトラクロロジベンゾ-p-ダイオキシン(TCDD)のP450酵素による代謝研究を行うに当たり、まずはじめに、TCDDおよびその代謝物の分離・測定法およびTCDD代謝物の抽出法の検討を行い、TCDDおよびその代謝物の測定法を確立した。次いで、本測定法をラット肝ミクロソームを酵素源とした場合のTCDDの代謝物の検出に応用し、本法が有効であることを確かめた。
1)内分泌かく乱物質によるP450分子種発現への影響:動物種差
PCBのメチルスルホン代謝物には、肝臓のグルクロニルトランスフェラーゼ(UGT)1A1や1A6を誘導する作用があること、また、これによりチロキシン(T4)の代謝が亢進され、血中T4濃度が低下することなどをすでに明らかにしてきている。このようにメチルスルホン代謝物に内分泌かく乱作用のあるPCB類では、その代謝パターンやこの代謝に関わる酵素の質的量的相違が、各動物のこれら内分泌かく乱物質に対する感受性の相違を支配する要因になると考えられる。そこで、2,2',4',5,5'-ペンタクロロビフェニール(CB101)および2,2',3',4',5,6-ヘキサクロロビフェニール(CB132)を試料として、ラットとマウスに投与した後の糞中および肝臓中の含硫代謝物量、チトクロームP450(P450 と略す)やUGTなどの薬物代謝酵素活性などそれぞれ測定し、ラットとマウス間におけるそれらの種差を検討した。また、精巣におけるアンドロゲンの合成阻害や肝の増殖作用があることが知られている鉛イオン(硝酸鉛)を試料として、ラットの肝や精巣における薬物代謝酵素 (P450分子種:CYP1A1/2、3A1/3A2など)や ステロイドホルモン合成に関わるP450分子種(CYP51やCYP11)の発現への影響をRT-PCR法を用いて検討した。
2)植物成分からの内分泌かく乱物質の検索
これまで、植物性内分泌かく乱物質としては、ゲニスチン、クメステロールなどの植物性エストロゲン様作用化合物が注目を浴び、多数の化合物が分離・同定されてきている。一方、植物成分にはその他のホルモン様作用化合物の存在が示唆されているが、それらについての詳細な研究は行われていない。そこで、本研究では、糖代謝のみならずストレスや中枢神経系機能の調節に深く関わる副腎皮質ホルモンのグルココルチコイド(GC)に着目し、様々な生薬・植物のエキスの粗画分を出発材料として、GC様作用を有する化合物の検索および同定を以下の2方法を用いて行った。i)培養細胞(M1細胞)の分化誘導を指標とした検索法:GCによりマクロファージに分化誘導されるマウス骨髄性白血病由来M1細胞を用い、分化誘導作用(貪食能の誘導)を指標にした測定およびii)遺伝子プロモーター活性を指標とする検索法:GCに感受性遺伝子プロモーター(マウス乳ガンウイルスLTR由来)をレポーター遺伝子(ルシフェラーゼ)上流に連結した発現プラスミドをラット線維芽細胞3Y1に導入した細胞株を用いた測定。
3)種々P450分子種の発現機構の解明
P450分子種の発現機構の解析には培養細胞を用いることが有利であるが、現在まで種々P450分子種を発現する培養細胞株は樹立されていない。そこで、まず、ラット肝初代培養細胞より樹立した培養肝細胞株を用いて各種P450分子種の発現・誘導能を検討した。また、硝酸鉛処理時のCYP51分子種の発現変動をRT-PCR法を用いて検討した。
4)チトクロームP450誘導を指標とするin vitro毒性評価系の確立
ヒト組み換えP450(CYP1A1/1A2およびCYP1B1)発現系細胞を用いて、内分泌かく乱作用が懸念されているディーゼル排気粉塵抽出物や芳香族ニトロ化合物の代謝活性化およびこれら化合物のP450への影響を、主にumu試験 を用いて検索した。
5)ダイオキシン類のP450酵素による代謝とその種差・性差の解析
2,3,7,8-テトラクロロジベンゾ-p-ダイオキシン(TCDD)のP450酵素による代謝研究を行うに当たり、まずはじめに、TCDDおよびその代謝物の分離・測定法およびTCDD代謝物の抽出法の検討を行い、TCDDおよびその代謝物の測定法を確立した。次いで、本測定法をラット肝ミクロソームを酵素源とした場合のTCDDの代謝物の検出に応用し、本法が有効であることを確かめた。
結果と考察
PCB類や重金属類(鉛)などの内分泌かく乱物質をラットやマウスに投与し、内分泌かく乱物質の代謝パターンや、ホルモン合成・分解に関わる数種のP450酵素への影響を、それぞれ薬物代謝学的及び分子生物学的手法を用いて比較検討し、それぞれ測定した項目につき動物種差や臓器差(肝及び精巣)があることを見出した。また同時に、これまでほとんどの臓器で発現し、かつ発現変動が少ないと考えられていたコレステロール合成に関わるCYP51酵素の遺伝子が、PCB類や重金属類(鉛)投与時、各臓器の重量変化とともに変動することなどの新知見を得た。これらは、内分泌かく乱物質が代謝パターンや、ホルモン合成・分解酵素系を変動させること、さらに、その変動には動物種差があることを示している。また、グルココルチコイド(GC)に感受性な遺伝子プロモーター(マウス乳ガンウイルスLTR由来等)をレポーター遺伝子(ルシフェラーゼ)上流に連結した発現プラスミドをラット線維芽細胞3Y1に導入した細胞株の樹立に成功し、これを利用して種々の植物より新規グルココルチコイド様作用化合物を見出した。その他の成果として、1)樹立した培養肝細胞株は数種のP450分子種の発現制御機構の解明に有用であること、2)ヒト組み換えP450(CYP1A1/1A2およびCYP1B1)発現系細胞を用いて、内分泌かく乱作用が懸念されているディーゼル排気粉塵抽出物や芳香族ニトロ化合物の代謝活性化およびこれら化合物のP450への影響を、主にumu試験を用いて検索し、ディーゼル排気粉塵抽出物や芳香族ニトロ化合物のいずれの代謝活性化にも、CYP1B1が関与することを明らかにしたこと、3)2,3,7,8-テトラクロロジベンゾ-p-ダイオキシン(TCDD)およびその代謝物の分離・測定法を確立し、次いで、本法をラット肝ミクロソームを酵素源とした場合のTCDDの代謝物の検出に応用し、本法が有効であることを確認したことなどが挙げられる。
結論
本年度の代表的な研究成果として、1)PCB類や重金属類(鉛)の内分泌かく乱物質を種々の実験動物に投与し、内分泌かく乱物質の代謝パターンや、ホルモン合成・分解に関わる数種のP450酵素への影響を調べ、それぞれ測定した項目につき動物種差や臓器・組織差を見出したこと、2)これまで各組織・臓器で発現し、かつ発現変動が少ないと考えられていたコレステロール合成に関わるCYP51酵素の遺伝子が、鉛投与時、臓器・組織の重量変化とともに大きく変動することを見出したこと、及び3)GCに応答性をもつ遺伝子プロモーター(マウス乳ガンウイルスLTR由来)をレポーター遺伝子(ルシフェラーゼ)上流に連結した発現プラスミドを導入したラット線維芽細胞株の樹立に成功し、これを利用して種々の植物より新規グルココルチコイド様作用化合物を見出したことなどが挙げられる。上記結果は、内分泌かく乱物質に対する感受性の動物種差が、期待通り内分泌かく乱物質曝露時のP450酵素の発現変動の種差と関わっていること、また、植物成分にはGC様作用物質が多数含まれていることを示しており、今後さらに初期の実験計画に沿って研究を推し進めて行く。
公開日・更新日
公開日
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更新日
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