文献情報
文献番号
199900508A
報告書区分
総括
研究課題名
HIV感染/AIDSの感染病態とその生体防御に関する研究(総括研究報告書)
課題番号
-
研究年度
平成11(1999)年度
研究代表者(所属機関)
倉田 毅(国立感染症研究所)
研究分担者(所属機関)
- 岡慎一(国立国際医療センター)
- 生田和良(大阪大微生物病研究所ウイルス免疫分野)
- 高橋秀実(日本医大免疫学微生物学教室)
- 宮沢正顕(近畿大医学部免疫学教室)
- 松下修三(熊本大エイズ学研究センタ-病態制御分野)
- 向井鐐三郎(国立感染研筑波医学実験用霊長類センタ-)
- 佐多徹太郎(国立感染研エイズ研究センタ-)
- 横田恭子(国立感染研免疫部)
- 小柳義夫(東北大大学院生体防御)
- 滝口雅文(熊本大エイズ学研究センタ-ウイルス制御分野)
- 高橋秀宗(国立感染研感染病理部)
- 俣野哲朗(国立感染研エイズ研究センタ-)
研究区分
厚生科学研究費補助金 先端的厚生科学研究分野 エイズ対策研究事業
研究開始年度
平成9(1997)年度
研究終了予定年度
平成11(1999)年度
研究費
90,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
有効なワクチンや抗HIV療法を開発するためには、HIV感染者体内でのウイルスの分布、体内伝播の機序とHIV感染個体内におけるquasispeciesを調べ、それらの増殖を阻止する液性、細胞性免疫反応を明らかにし、その誘導法を確立する、またHIVの遺伝子変異と再活性化の機序を明らかにし、病態進行過程を詳細に解析し、体内での細胞死、それらを制御する生体防御機構との関係を明らかにする必要がある。遺伝子変異を凌駕する細胞障害性T細胞機能の活性化・増強機序を賦活・持続するワクチン、物質の開発を目指す。またエイズ治療を目的とした遺伝子治療に関する基礎研究を行う。上記の問題を解決していくために人の症例での病態の検討と同時に非人類霊長類発症系を用いて感染発症機序の解析とその制御法の開発を行なう必要がある。これらの研究から、医療上の感染の防止、HIV感染防御、エイズ進行防止に対する有効な手段が提供される。
研究方法
1)感染個体でのHIVの遺伝子変異、細胞死、宿主反応及び病態の進行について:急性感染期におけるHIV-1感染による免疫破壊機構を明らかにし、HIV感染/AIDSの経過中における体内ウイルス遺伝子変異は、ワクチン開発、発症防止剤等の開発においてきわめて重要な点である。このグル-プでは体内ウイルスを迅速、効率よく分離する系をつくり、体内でのHIV遺伝子の状態を把握し、耐性株発生機序、HIV-quasispeciesから中和抗体を逃れる機序、病態新興の理解のためにCD4+/CD8+のHIV感染比について検討する。さらにHIVのヘルパ-T細胞、マクロファ-ジにおけるM-tropic、T-tropic株の増殖性をみる。またエイズに合併するカポジ肉腫と新しいヘルペスウイルス8のDNAの関連について明らかにする。 2)非人類霊長類でのエイズ発症モデルとワクチンによる感染防御系の開発:SIV感染サル発症系を用い、SIVgag蛋白、及びSIVとマウスフレンドウイルスのキメラDNAを用いて感染阻止系の開発を試みる。 3)HIV感染下での細胞障害性T細胞の役割と免疫反応及びワクチンを目指した生体防御機序の解析:すでに同定したヒトのHIV-1 CTLエピト-プに加え新たなエピト-プの同定を試みる。またヘルパ-T細胞を含むペプチドワクチン免疫マウスでのCTL活性試験を行うと共にHIV由来抗原ペプチドによる特異的キラ-活性抑制とT細胞活性化因子の産出・放出をみる。また粘膜を介したHIV免疫反応の誘導と感染防御効果の検討を行う。 (倫理面への配慮)ヒトの検体を用いる場合には主治医が感染者/患者の同意を機関毎に得ている。また動物実験は機関毎の委員会の承認のもとに実施されている。
結果と考察
1)感染個体でのウイルス(HIV)の遺伝子変異、細胞死、宿主反応等病態の進行について:Magic5細胞を用いM-およびT-tropicウイルスを迅速容易に分離し、15時間で耐性結果が得られる系を確立した(岡)。また健常者のPBMCからCD4T細胞を得、粒子吸着させるとアポトーシス誘導エフェクター活性を獲得し、CCR5の発現はCD38-分画に高く、かつM-tropicウイルスは200倍以上のウイルス産生能を示した。またIL-2誘導Th1細胞あるいはマクロファージにM-tropicあるいはT-tropic HIV-1を感染させると侵入効
率と増殖効率に違いがあり、宿主細胞因子がウイルス増殖性に関与することが示された。これは病態進行をCD38+/-細胞率を指標に予測しうるとともにM-からT-tropicウイルスへのシフトの機構の解明につながると考えられる(生田、山岡)。患者でみると、急性感染者から分離されるウイルスはTh1細胞とマクロファージに効率よく増殖するウイルスが大部分であった。またウイルス遺伝子の解析からHIV-1抗体陰性あるいは陽転者においても、変異効率は極めて高いことが判明した(小柳)。HIVクワシスピーシスの急激な変化と中和抗体からのエスケープの機序の解析から、また中和領域のgp120抗原ペプチドの免役実験(マウス)から中和のエピトープを選んで免疫することにより変異株の中和も可能である(松下)。HIV-1持続感染T細胞株のHIV-1産生はAC由来CD8細胞により抑制された(神奈木)。アラキドン酸修飾により、ヒト単球細胞膜表面のHIV-1感染レセプターであるCD4およびCXCR4の発現を低下させウイルスと細胞の結合およびウイルス産生量を低下させることがわかった。この点から発症予防剤の開発や宿主要因としての膜脂質の関与の解析の展開が期待される(天野)。エイズにおけるカポジ肉腫には腫瘍細胞である紡錘型細胞と内皮細胞の核内にHHV8の潜伏感染時にあらわれるORF73蛋白が多量に出現していることがわかった。また感染者の血清診断ELISA系とHHV8関連蛋白を組織中に検出する系を確立した(佐多、倉田)。 2)非人類霊長類でのエイズ発症モデルとワクチンによる感染制御系の開発:SIVgag蛋白抗原をリポゾームに封入したものをサルに免疫(皮下注射)し、SIVを接種したところ血中ウイルス量は免疫群、非免疫群に差が見られず、感染阻止はできなかった(向井)。SIVとマウスフレンドウイルスとのキメラSIV(FMSIV)DNAとFMLVレセプター発現DNAをDNAワクチンとしてサルに接種したところ限局的FMSIV複製の誘導がみられた。この方法の改良により有効かつ安全な方法となりうる可能性がある(俣野)。 3)HIV感染下での細胞障害性T細胞の役割と免疫反応、およびワクチンを目指した生体防御機序の解析:HIVペプチド抗原処理によりキラー活性が低下したCTLの培養上清中には大量の様々なサイトカインが含まれており、それらは未刺激のCTLやヘルパーT細胞を活性化しうることが明らかになり、かつキラーT細胞にもヘルパー機能が存在発揮されることを証明した。こうしたウイルス産物によるCTL破壊を防ぎ機能低下を速やかに改善させる方策が必要である(高橋)。HLA-B*3501拘束性HIV-1 CTLエピトープペプチドの夫々の4量体(テトラマー)結合アピシンは、夫々エピトープに特異的CTLクローンに特異的に結合した。これにより多種類のエピトープに対するCD8+ T細胞を定量的に解析できる方法が確立された(滝口)。HIV-1gag発現ベクターDNAを筋肉内に注射し、鼻粘膜に蛋白抗原をCTと共に追加免疫することにより得られるCTL活性、抗体は上昇し、全身性のDNA免疫により粘膜面のCTL活性の増強が可能である(横田)。レトロウイルスgag抗原上の感染防御性および非防御性CD4陽性T細胞エピトープの解析から強いCD4Tリンパ球活性能とIL-4産生誘導能を有する57-86(コア構造)は全く感染防御能を示さないことはTh1タイプの反応が感染抵抗性に、Th2タイプ反応が病態の進行に関連することと一致する(宮沢)。天然物からのHIV遺伝子発現抑制をみるためにHIVプロモーター領域500-bpミルシフェラーゼ遺伝子上流に組込んだ発現ベクターを作製し、このプラスミドをヒトT細胞株Jurkatにトランスフェクトし、種々の天然化合物を培地に添加することにより抑制効果をみることが可能となった(田沼)。
率と増殖効率に違いがあり、宿主細胞因子がウイルス増殖性に関与することが示された。これは病態進行をCD38+/-細胞率を指標に予測しうるとともにM-からT-tropicウイルスへのシフトの機構の解明につながると考えられる(生田、山岡)。患者でみると、急性感染者から分離されるウイルスはTh1細胞とマクロファージに効率よく増殖するウイルスが大部分であった。またウイルス遺伝子の解析からHIV-1抗体陰性あるいは陽転者においても、変異効率は極めて高いことが判明した(小柳)。HIVクワシスピーシスの急激な変化と中和抗体からのエスケープの機序の解析から、また中和領域のgp120抗原ペプチドの免役実験(マウス)から中和のエピトープを選んで免疫することにより変異株の中和も可能である(松下)。HIV-1持続感染T細胞株のHIV-1産生はAC由来CD8細胞により抑制された(神奈木)。アラキドン酸修飾により、ヒト単球細胞膜表面のHIV-1感染レセプターであるCD4およびCXCR4の発現を低下させウイルスと細胞の結合およびウイルス産生量を低下させることがわかった。この点から発症予防剤の開発や宿主要因としての膜脂質の関与の解析の展開が期待される(天野)。エイズにおけるカポジ肉腫には腫瘍細胞である紡錘型細胞と内皮細胞の核内にHHV8の潜伏感染時にあらわれるORF73蛋白が多量に出現していることがわかった。また感染者の血清診断ELISA系とHHV8関連蛋白を組織中に検出する系を確立した(佐多、倉田)。 2)非人類霊長類でのエイズ発症モデルとワクチンによる感染制御系の開発:SIVgag蛋白抗原をリポゾームに封入したものをサルに免疫(皮下注射)し、SIVを接種したところ血中ウイルス量は免疫群、非免疫群に差が見られず、感染阻止はできなかった(向井)。SIVとマウスフレンドウイルスとのキメラSIV(FMSIV)DNAとFMLVレセプター発現DNAをDNAワクチンとしてサルに接種したところ限局的FMSIV複製の誘導がみられた。この方法の改良により有効かつ安全な方法となりうる可能性がある(俣野)。 3)HIV感染下での細胞障害性T細胞の役割と免疫反応、およびワクチンを目指した生体防御機序の解析:HIVペプチド抗原処理によりキラー活性が低下したCTLの培養上清中には大量の様々なサイトカインが含まれており、それらは未刺激のCTLやヘルパーT細胞を活性化しうることが明らかになり、かつキラーT細胞にもヘルパー機能が存在発揮されることを証明した。こうしたウイルス産物によるCTL破壊を防ぎ機能低下を速やかに改善させる方策が必要である(高橋)。HLA-B*3501拘束性HIV-1 CTLエピトープペプチドの夫々の4量体(テトラマー)結合アピシンは、夫々エピトープに特異的CTLクローンに特異的に結合した。これにより多種類のエピトープに対するCD8+ T細胞を定量的に解析できる方法が確立された(滝口)。HIV-1gag発現ベクターDNAを筋肉内に注射し、鼻粘膜に蛋白抗原をCTと共に追加免疫することにより得られるCTL活性、抗体は上昇し、全身性のDNA免疫により粘膜面のCTL活性の増強が可能である(横田)。レトロウイルスgag抗原上の感染防御性および非防御性CD4陽性T細胞エピトープの解析から強いCD4Tリンパ球活性能とIL-4産生誘導能を有する57-86(コア構造)は全く感染防御能を示さないことはTh1タイプの反応が感染抵抗性に、Th2タイプ反応が病態の進行に関連することと一致する(宮沢)。天然物からのHIV遺伝子発現抑制をみるためにHIVプロモーター領域500-bpミルシフェラーゼ遺伝子上流に組込んだ発現ベクターを作製し、このプラスミドをヒトT細胞株Jurkatにトランスフェクトし、種々の天然化合物を培地に添加することにより抑制効果をみることが可能となった(田沼)。
結論
当班の研究は、ヒト宿主レベルあるいは動物モデル(サル)での免疫不全ウイルス感染による病態解明を通してその成果を感染防御ワクチン、感染者の発症阻止剤等の開発へ役立てることである。この3年間で感染者の体内のウイルス遺伝子の変異の機序、非感染細胞が破壊される機序、細胞障害性機序等の研究が推進され、またサルのエイズ病態モデルも確立され、今後これらを総合してワクチン開発への応用の発展が期待される。HIV感染では
ヒトが健常で生存しうるための免疫能を担う重要な細胞群が破壊されることが最も重要である。さらに体内に入った後次々と遺伝子の変異を起こしていくウイルスについて、ワクチンの開発に成功したことは世界的にも全くないことから、ワクチン開発は容易ではない。世界的にも現在用いられている薬剤を除き感染防御方法もない以上基礎・臨床あらゆる角度から研究を行う必要がある。
ヒトが健常で生存しうるための免疫能を担う重要な細胞群が破壊されることが最も重要である。さらに体内に入った後次々と遺伝子の変異を起こしていくウイルスについて、ワクチンの開発に成功したことは世界的にも全くないことから、ワクチン開発は容易ではない。世界的にも現在用いられている薬剤を除き感染防御方法もない以上基礎・臨床あらゆる角度から研究を行う必要がある。
公開日・更新日
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