文献情報
文献番号
199900455A
報告書区分
総括
研究課題名
Vero毒素のトキソイドワクチンの開発とO157感染症発症防止に関する研究(総括研究報告書)
課題番号
-
研究年度
平成11(1999)年度
研究代表者(所属機関)
高橋 元秀(国立感染症研究所)
研究分担者(所属機関)
- 荒川宜親(国立感染症研究所 細菌・血液製剤部)
- 倉田 毅(同、感染病理部)
- 渡邉治雄(同、細菌部)
- 小室勝利(同、安全性研究部)
- 山田章雄(同、つくば霊長類センター)
- 網 康至(同、動物管理室)
研究区分
厚生科学研究費補助金 先端的厚生科学研究分野 新興・再興感染症研究事業
研究開始年度
平成9(1997)年度
研究終了予定年度
平成11(1999)年度
研究費
19,800,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
EHEC感染症の発病予防に、トキソイドワクチンによる予防効果とウマ抗毒素による治療の有効性を、本研究で確立した動物モデルを用い検討する。また、作製したウマ抗毒素血清を用い、ジフテリア等の治療に現在用いられている筋肉内又は静脈内投与法の有効性を検討する。さらに、EHECが腸管内で産生した毒素、または抗生物質療法で菌体より遊離した毒素を特異的に吸着除去する療法を合わせて検討する。一方、作製した抗毒素を標準化し、標準品として国内外に供給する。特に、抗VT2血清はWHOにおいても国際標準品が用意されていないため、精度管理された技術、測定法を用いて標準化を行いWHOに標準品として提供する。
研究方法
(1)菌の大量培養と毒素精製に関する検討:腸管出血性大腸菌O157:H7の感染、発症に主要な役割を演じているVero毒素(VT1 又はVT2)の遺伝子を組み込んだプラスミドを保有するE.coli株を大量培養・精製する方法を再検討し、精製の効率化を検討した。
(2)EHEC:O157感染動物モデルの作製と病理組織学的解析:昨年度に引き続き各種実験動物のVero毒素投与後の発病機構に関する検討をおこなった。特に、ヒトに近縁な実験用サル類を用いて、HUSおよび脳症モデルの作成を試みた。
(3)トキソイドワクチンの試作と評価:昨年までに、リポソーム結合ベロトキシン(VT1およびVT2)をマウスに投与することにより、致死量のVT1あるいはVT2に対する抵抗性が
誘導されることを確認した。本年度は、より高次の動物としてサルを用いた検討を行った。
(4)HUS患者から単離されたStx2産生性大腸菌O86:HNMの病原因子に関する研究:1999年9月、志賀毒素産生性大腸菌(STEC) O86:HNMの感染による死亡例が報告された。この菌株が持つ病原因子の分布についてPCRとサザンハイブリダイゼーションを用いて解析した。
(5)標準品及び治療用抗毒素用のウマ抗毒素血清の作製:VT2-リポゾームワクチンとVT2
で高度免疫したウマから、経時的に採血して得た血清を用いて、昨年度までに確立した試験法により標準品の候補品を標準化し、また抗毒素による治療製剤を製造する。
(2)EHEC:O157感染動物モデルの作製と病理組織学的解析:昨年度に引き続き各種実験動物のVero毒素投与後の発病機構に関する検討をおこなった。特に、ヒトに近縁な実験用サル類を用いて、HUSおよび脳症モデルの作成を試みた。
(3)トキソイドワクチンの試作と評価:昨年までに、リポソーム結合ベロトキシン(VT1およびVT2)をマウスに投与することにより、致死量のVT1あるいはVT2に対する抵抗性が
誘導されることを確認した。本年度は、より高次の動物としてサルを用いた検討を行った。
(4)HUS患者から単離されたStx2産生性大腸菌O86:HNMの病原因子に関する研究:1999年9月、志賀毒素産生性大腸菌(STEC) O86:HNMの感染による死亡例が報告された。この菌株が持つ病原因子の分布についてPCRとサザンハイブリダイゼーションを用いて解析した。
(5)標準品及び治療用抗毒素用のウマ抗毒素血清の作製:VT2-リポゾームワクチンとVT2
で高度免疫したウマから、経時的に採血して得た血清を用いて、昨年度までに確立した試験法により標準品の候補品を標準化し、また抗毒素による治療製剤を製造する。
結果と考察
(1)VT1又はVT2遺伝子を担う組み換えプラスミドを保有する大腸菌を培養後、10Lの培養液から得られる培養菌液(Tp8株)から、菌の超音波破砕処理、40%硫酸アンモニウム沈澱法、60%硫酸アンモニウム沈澱法、DEAE セファロース、さらにハイロード Q セファロースの精製過程を経て、総ラテックス活性で108LUのVT2が得られた。精製VT2の回収率は菌の粗毒素の約10%であった。菌の産生した低分子タンパクや培地成分をあらかじめ除去する事により、その後の工程における不純物と毒素タンパクとの結合を防止することが出来ると考える。
(2)成体カニクイザル3頭に、それぞれ1マウスLD50/Kg/日の精製Vero毒素VT-1を3日および5日連続投与、0.1マウスLD50/Kg/日のVT-1を5日間連続して静脈内投与した。毒素投与後1-3日間隔で採血し、臨床的、血液学的、免疫学的変化を調査すると共に、脳波測定をおこなった。今回の投与量では死亡例はみられなかったが、いずれの個体も投与後に食欲不振と体重減少が観察された。1マウスLD50、5日間連続投与個体では、投与後8日目に後肢のわずかな振戦が観察された。血清生化学的変化では、1マウスLD50を投与した2頭で、血清中のCPK、LDH、BUN、CREの一過性の上昇が認められた。末梢リンパ球サブセットでは投与量、投与日数に関わらず3頭のいずれでもCD69またはDR陽性の活性化リンパ球が増加した。一方、脳波には顕著な変化はみられなかった。病理組織学的な観察では、病変がみられた動物においては血管内皮の傷害、腎尿細管上皮の病変に起因する病態が毒素の投与量、期間に相関して認められた。血管内皮の傷害によって引き起こされた病変としては腸管の出血、腎糸球体病変、肺水腫、くも膜下出血、脳浮腫などがみられた。毒素投与によって急性期に死亡した動物はVT1投与群では循環傷害による心筋梗塞、肺水腫が、VT2投与では出血性腸炎による失血が死因であった。いずれの動物においても尿細管の病変、糸球体病変がみられたため毒素の少量、連続投与を試みたところ、臨床的に神経症状や腎不全の所見が得られ、組織学的にも脳浮腫や糸球体病変を得ることができた。これらの病変はO157感染患者にみられる臨床症状やHUS所見と類似していることから、本実験系がHUS、脳症、出血性腸炎の動物モデルとして有用であると結論した。
(3)サルにリポソーム結合VT2を投与することにより、顕著な抗VT2 IgG抗体産生が誘導された。この免疫血清中には高値の中和抗体が含まれることがVero細胞を用いた中和試験によって確かめられた。リポソーム結合抗原はサルにおいてもVT2-リポソームは抗VT2 IgE抗体産生を選択的に抑制することが確かめられた。なお、研究年度内では完了しなかったが、免疫中のサルはVT2を静脈内注射して、発症防御効果を確認する予定である。
(4)患者から単離されたStx2産生性大腸菌O86:HNMは多くのSTECまたは腸管病原性大腸菌(EPEC)で、宿主細胞表層の不可逆的な壊変に必要とされる因子をコードするeaeAと、多くのEPECで宿主細胞への接着因子として機能している繊毛遺伝子bfpAを保持しない一方で、腸管凝集性大腸菌(EAEC)に特徴的な病原性プラスミドを保有することが明らかとなった。HEp-2細胞を用いてin vitroでの宿主細胞への接着様式を調べたところ、EAECに特徴的な凝集性接着能を示したことから、この菌株はSTECとEAECの両方の特徴を持つ大腸菌であることが明らかとなった。一方、STEC O157:H7の典型的な菌株であるEDL933株に溶原化しているstx2ファージと、構造的、機能的に相同性のあるファージにコードされていることが判明した。
(5)高度免疫した約8リッターのウマ血清を得た。この血清は濾過膜通過後、標準抗毒素の候補用として、2mlずつ小分け後凍結乾燥したものを約2000本作製した。治療用抗毒素として、現行の抗毒素製剤と同様な工程でペプシン処理・精製した後、2mlずつ小分け-凍結乾燥したもの約1500本製造した。力価試験は、本研究班で確立したマウスを用いた中和試験法で定量した結果、2mlで溶解後100倍希釈した1mlは200-400 LD50のVT2を中和し、1000倍希釈した1mlは20-40 LD50のVT2を中和した。4回の試験成績を統計解析した結果、抗毒素の希釈と毒素の用量反応線が得られる区間を明らかにした。また、治療用の抗毒素の力価は、ペプシン消化、精製工程操作により多少低下し、標準品の約1/2の中和抗毒素価であった。腸管内の毒素を特異的に中和する経口投与用抗毒素は、粘張剤とともに抗毒素抗体を腸溶カプセルに充填し、パイロット剤を作製し、サルで効果確認試験を予定している。抗VT1の標準品については、現在ウマを免疫中であるが、VT2に比べ抗毒素価の上昇は高くない。しかし、国内標準品と治療用の抗毒素作製量は確保できる見込みである。
(2)成体カニクイザル3頭に、それぞれ1マウスLD50/Kg/日の精製Vero毒素VT-1を3日および5日連続投与、0.1マウスLD50/Kg/日のVT-1を5日間連続して静脈内投与した。毒素投与後1-3日間隔で採血し、臨床的、血液学的、免疫学的変化を調査すると共に、脳波測定をおこなった。今回の投与量では死亡例はみられなかったが、いずれの個体も投与後に食欲不振と体重減少が観察された。1マウスLD50、5日間連続投与個体では、投与後8日目に後肢のわずかな振戦が観察された。血清生化学的変化では、1マウスLD50を投与した2頭で、血清中のCPK、LDH、BUN、CREの一過性の上昇が認められた。末梢リンパ球サブセットでは投与量、投与日数に関わらず3頭のいずれでもCD69またはDR陽性の活性化リンパ球が増加した。一方、脳波には顕著な変化はみられなかった。病理組織学的な観察では、病変がみられた動物においては血管内皮の傷害、腎尿細管上皮の病変に起因する病態が毒素の投与量、期間に相関して認められた。血管内皮の傷害によって引き起こされた病変としては腸管の出血、腎糸球体病変、肺水腫、くも膜下出血、脳浮腫などがみられた。毒素投与によって急性期に死亡した動物はVT1投与群では循環傷害による心筋梗塞、肺水腫が、VT2投与では出血性腸炎による失血が死因であった。いずれの動物においても尿細管の病変、糸球体病変がみられたため毒素の少量、連続投与を試みたところ、臨床的に神経症状や腎不全の所見が得られ、組織学的にも脳浮腫や糸球体病変を得ることができた。これらの病変はO157感染患者にみられる臨床症状やHUS所見と類似していることから、本実験系がHUS、脳症、出血性腸炎の動物モデルとして有用であると結論した。
(3)サルにリポソーム結合VT2を投与することにより、顕著な抗VT2 IgG抗体産生が誘導された。この免疫血清中には高値の中和抗体が含まれることがVero細胞を用いた中和試験によって確かめられた。リポソーム結合抗原はサルにおいてもVT2-リポソームは抗VT2 IgE抗体産生を選択的に抑制することが確かめられた。なお、研究年度内では完了しなかったが、免疫中のサルはVT2を静脈内注射して、発症防御効果を確認する予定である。
(4)患者から単離されたStx2産生性大腸菌O86:HNMは多くのSTECまたは腸管病原性大腸菌(EPEC)で、宿主細胞表層の不可逆的な壊変に必要とされる因子をコードするeaeAと、多くのEPECで宿主細胞への接着因子として機能している繊毛遺伝子bfpAを保持しない一方で、腸管凝集性大腸菌(EAEC)に特徴的な病原性プラスミドを保有することが明らかとなった。HEp-2細胞を用いてin vitroでの宿主細胞への接着様式を調べたところ、EAECに特徴的な凝集性接着能を示したことから、この菌株はSTECとEAECの両方の特徴を持つ大腸菌であることが明らかとなった。一方、STEC O157:H7の典型的な菌株であるEDL933株に溶原化しているstx2ファージと、構造的、機能的に相同性のあるファージにコードされていることが判明した。
(5)高度免疫した約8リッターのウマ血清を得た。この血清は濾過膜通過後、標準抗毒素の候補用として、2mlずつ小分け後凍結乾燥したものを約2000本作製した。治療用抗毒素として、現行の抗毒素製剤と同様な工程でペプシン処理・精製した後、2mlずつ小分け-凍結乾燥したもの約1500本製造した。力価試験は、本研究班で確立したマウスを用いた中和試験法で定量した結果、2mlで溶解後100倍希釈した1mlは200-400 LD50のVT2を中和し、1000倍希釈した1mlは20-40 LD50のVT2を中和した。4回の試験成績を統計解析した結果、抗毒素の希釈と毒素の用量反応線が得られる区間を明らかにした。また、治療用の抗毒素の力価は、ペプシン消化、精製工程操作により多少低下し、標準品の約1/2の中和抗毒素価であった。腸管内の毒素を特異的に中和する経口投与用抗毒素は、粘張剤とともに抗毒素抗体を腸溶カプセルに充填し、パイロット剤を作製し、サルで効果確認試験を予定している。抗VT1の標準品については、現在ウマを免疫中であるが、VT2に比べ抗毒素価の上昇は高くない。しかし、国内標準品と治療用の抗毒素作製量は確保できる見込みである。
結論
毒素の精製方法を再検討では、粗毒素を60%飽和の一段階工程より40%の工程を組み入れることにより純度が上昇した。この結果、回収率が低下したが、比活性の上昇を考えたときに充分メリットが得られたと考える。小動物およびカニクイザルを用いてVT1あるいはVT2毒素を投与し、生体への影響を病理組織学的に検索した結果、Vero毒素は血管内皮細胞の傷害、腎尿細管上皮、腸管出血を引き起こすことが明らかとなった。これらの病態は動物種により特徴的であり、モデル動物として有用であると考える。特にカニクイザルにVT1、VT2いずれも少量の毒素を連続的に静脈内投与することによってO157感染患者にみられるHUS、脳症と同様の病態を引き起こすことが病理組織学的に明らかになった。また、少量VT-1をカニクイザルに連続投与した結果、CPK、LDH、BUN、CREなどの組織損傷を反映すると見られる測定値が一過性に上昇し、後肢の軽微な振戦が認められた。脳波には異常をみとめなかったが、血液・生化学検査値および血液凝固能に慢性的な変化が認められたことはHUSおよび脳症発症モデルが作成できる可能性がある。リポソ-ム結合抗原はVeroトキソイド、あるいはVeroトキシンワクチンの創製に応用することが、ヒトに近縁な実験用サルを用いた実験で安全性、有効性に問題がないことが確認できた。HUS患者由来のSTEC O86:HNM株は、STECに加え、EAECの特徴を示すことが判明した。HUS由来のO86:HNM株に存在するstx2は、ファージゲノム上にコードされており、STEC O157:H7の菌株に溶原化しているstx2ファージと、構造的、機能的に類似したものであることが判明した。VT2に対する標準抗毒素の候補品と緊急用治療用の抗毒素製剤を作製した。
公開日・更新日
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