文献情報
文献番号
199900451A
報告書区分
総括
研究課題名
粘膜免疫機構の基盤と応用
課題番号
-
研究年度
平成11(1999)年度
研究代表者(所属機関)
田村 慎一(国立感染症研究所)
研究分担者(所属機関)
- 岩崎琢也(国立感染症研究所)
- 清野 宏(大阪大学微生物病研究所)
- 西沢俊樹(国立感染症研究所)
- 五十君静信(国立感染症研究所)
- 坂口雅弘(国立感染症研究所)
研究区分
厚生科学研究費補助金 先端的厚生科学研究分野 新興・再興感染症研究事業
研究開始年度
平成10(1998)年度
研究終了予定年度
平成12(2000)年度
研究費
20,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
広大な粘膜面を介して生体に感染し病気を起こす多くの細菌やウイルスに対して、生体はIgA抗体関与の粘膜免疫機構によって感染による病気から回復し、回復後の再感染に対する特異的な強い免疫能力を準備する。粘膜ワクチンは、発病を防ぐために予め投与される抗原であり、それによって感染の際に誘導されるのと同等に強い免疫能力を生体に準備することがその理想条件になる。本研究は、ウイルスや細菌感染に伴う、また、粘膜ワクチンの投与に伴う粘膜免疫応答とその制御機構を、粘膜関連リンパ系の分子・細胞・組織のレベルで明らかにすると共に、それを基礎に予防効果の高い安全な粘膜ワクチンを開発することを目的としている。
研究方法
1.粘膜ワクチンの有効性の免疫学的基礎の解析。1)現行のインフルエンザ不活化ワクチンをアジュバント〔微量のコレラトキシン(CT)を含むそのBサブユニット;CTB*〕と共に経鼻投与した時の免疫増強のメカニズムを明らかにするために、CTB* 併用ワクチンあるいはCTB*のみを経鼻免疫後の様々な日にウイルス感染をして、CTB*免疫のウイルス増殖(感染3日目)に及ぼす影響を検討した(田村)。2)インフルエンザのモデルマウスにおいて、ウイルス感染後の感染部位の組織像、polymeric immunoglobulin receptor (pIgR)の発現、上気道におけるIgA産生形質細胞の分布等を検討した(岩崎)。3)気道の粘膜免疫の誘導組織である鼻咽頭関連リンパ組織(NALT)と実行組織である鼻腔粘膜固有層(NP)におけるB細胞の性状を検討した(清野)。
2.新しい粘膜ワクチンの開発。1)有効かつ安全な粘膜アジュバントの一つの候補である大腸菌易熱性毒素(LT)の変異LT 44HA(LTのAサブユニットの44番目のアミノ酸をHis からAlaに置換)のアジュバント併用経鼻インフルエンザワクチンのアジュバントとしての有用性を検討した(田村)。2)う蝕病原菌(Streptococcus mutans)の初期付着因子(菌体表層蛋白質抗原:PAc)に対する阻害抗体のみを誘導できる最小のペプチド抗原(13残基)をユニットとした様々なペプチドをデザインして抗体誘導能を検討した(西沢)。3)経口ワクチンのベクターとしての乳酸菌の有用性を検討するために、出血性大腸菌O157のベロトキシン1(VT-1)のエピトープを分泌型のベクターに組み込み、乳酸菌を形質転換し、これを経口投与したときのVT1に特異的な抗体応答を検討した(五十君)。
3.粘膜アレルギー抑制機構の解析。1)スギ花粉症の主要なアレルゲンであるCryj1のT細胞エピトープとインバリアント鎖の遺伝子を融合したcDNAをpCAGGSプラスミドに組み込み、これを筋肉内に免疫したときの花粉特異的なIgE抗体応答と、この免疫マウスの脾臓の細胞をアレルゲンと共に培養したときのサイトカイン産生を検討した(坂口)。
2.新しい粘膜ワクチンの開発。1)有効かつ安全な粘膜アジュバントの一つの候補である大腸菌易熱性毒素(LT)の変異LT 44HA(LTのAサブユニットの44番目のアミノ酸をHis からAlaに置換)のアジュバント併用経鼻インフルエンザワクチンのアジュバントとしての有用性を検討した(田村)。2)う蝕病原菌(Streptococcus mutans)の初期付着因子(菌体表層蛋白質抗原:PAc)に対する阻害抗体のみを誘導できる最小のペプチド抗原(13残基)をユニットとした様々なペプチドをデザインして抗体誘導能を検討した(西沢)。3)経口ワクチンのベクターとしての乳酸菌の有用性を検討するために、出血性大腸菌O157のベロトキシン1(VT-1)のエピトープを分泌型のベクターに組み込み、乳酸菌を形質転換し、これを経口投与したときのVT1に特異的な抗体応答を検討した(五十君)。
3.粘膜アレルギー抑制機構の解析。1)スギ花粉症の主要なアレルゲンであるCryj1のT細胞エピトープとインバリアント鎖の遺伝子を融合したcDNAをpCAGGSプラスミドに組み込み、これを筋肉内に免疫したときの花粉特異的なIgE抗体応答と、この免疫マウスの脾臓の細胞をアレルゲンと共に培養したときのサイトカイン産生を検討した(坂口)。
結果と考察
1.粘膜ワクチンの有効性の免疫学的基礎の解析。1)CTB* 併用ワクチンを経鼻投与した場合にもCTB*のみを経鼻投与した場合にも、投与後3日目位からウイルス増殖(感染3日目のウイルス価)が抑制され、CTB*が非特異的にウイルス増殖を抑制する自然免疫を誘導していることが示された。CTB*投与後3日目のNALTには、非特異的にウイルス増殖を抑制するNK細胞の活性を高めるIL-15、IL-18等のmRNAの誘導が確認された。また、この時動き出したサイトカインの一つであるIL-1が、ワクチンに特異的な粘膜免疫応答を誘導する引き金になっていることが示された(田村)。2)感染2-3日に上皮下に顆粒球が浸潤し、4-5日に上皮の重層化が認められる。ウイルス抗原は、感染24時間後には感染上皮細胞の核にその後細胞質に検出される。感染細胞は、円柱上皮ばかりでなく嗅上皮にも検出され、感染10日目には検出されなくなる。感染5日目頃から免疫組織化学的にIgA陽性細胞がNALTの近傍に多く観察されるようになり、感染7日目の1割面でのNALT 領域のIgA陽性細胞と非NALT領域のIgA陽性細胞の分布は50:1であった。IgG陽性細胞は感染7日目頃から観察されたが、IgA陽性細胞の1/20位であった(岩崎)。3)IgA産生に関与するB細胞は、B220、C5、Mac-1の発現様式により、B1 とB2に分けられる。NALTにおいては全B細胞の1/10がB1であり、一方、NPでは3/5がB1であった。従って、NALTのB細胞の大部分がB2であることから、NPに多く検出されるB1は粘膜の誘導組織とは独立に実行組織に出現する IgA産生細胞であることが示唆された。
2.新しい粘膜ワクチンの開発。1)大腸菌易熱性毒素(LT)の変異LT 44HAは、既に経鼻インフルエンザワクチンのアジュバントとしてヒトでの有効性が確認されている1%LT添加ITB(LTB*)に比較して毒性(Y-1細胞試験や腸管ループ試験において)が低く、100ugのアジュバントを腹腔内に投与した場合も下痢をおこすようなことはなかった。一方、粘膜免疫応答誘導能も防御能がLTB*に比較して多少低かった(田村)。2)う蝕病原菌の初期付着因子に対する阻害抗体のみを誘導できる最小のペプチド抗原(13残基)をユニットとした様々なペプチドをデザインした。そのうち、3量体を直列連結(タンデム型)し連結部のスペーサーにリジンダイマーを用いたものが最も阻害抗体誘導能が高かった(西沢)。3)病原性大腸菌O157のVerotoxin 1(VT1)のエピトープを組み込んだ乳酸菌Lactococcus lactis IL1403は、それを経口投与されたマウスにおいて、VT1に特異的な血清及び腸洗浄液中のIgA及び IgG抗体応答を高めた(五十君)。
3.粘膜アレルギー抑制機構の解析。1)Cryj1のT細胞エピトープとインバリアント鎖の遺伝子を融合したcDNAをpCAGGSプラスミドに組み込み、これを筋肉内に免疫したマウスにおいて、アレルゲン特異的なIgE抗体産生が抑制された。また、免疫マウスの脾臓の細胞をアレルゲンと共に培養したときTh1型のサイトカインが産生された。インバリアント鎖はエンドゾーム系への移行シグナルを持つためMHCクラスII分子へのT細胞エピトープの結合を助けると考えられており、このDNAワクチンによってアレルゲンに対するT細胞応答のみが誘導されたことが示唆された(坂口)。
2.新しい粘膜ワクチンの開発。1)大腸菌易熱性毒素(LT)の変異LT 44HAは、既に経鼻インフルエンザワクチンのアジュバントとしてヒトでの有効性が確認されている1%LT添加ITB(LTB*)に比較して毒性(Y-1細胞試験や腸管ループ試験において)が低く、100ugのアジュバントを腹腔内に投与した場合も下痢をおこすようなことはなかった。一方、粘膜免疫応答誘導能も防御能がLTB*に比較して多少低かった(田村)。2)う蝕病原菌の初期付着因子に対する阻害抗体のみを誘導できる最小のペプチド抗原(13残基)をユニットとした様々なペプチドをデザインした。そのうち、3量体を直列連結(タンデム型)し連結部のスペーサーにリジンダイマーを用いたものが最も阻害抗体誘導能が高かった(西沢)。3)病原性大腸菌O157のVerotoxin 1(VT1)のエピトープを組み込んだ乳酸菌Lactococcus lactis IL1403は、それを経口投与されたマウスにおいて、VT1に特異的な血清及び腸洗浄液中のIgA及び IgG抗体応答を高めた(五十君)。
3.粘膜アレルギー抑制機構の解析。1)Cryj1のT細胞エピトープとインバリアント鎖の遺伝子を融合したcDNAをpCAGGSプラスミドに組み込み、これを筋肉内に免疫したマウスにおいて、アレルゲン特異的なIgE抗体産生が抑制された。また、免疫マウスの脾臓の細胞をアレルゲンと共に培養したときTh1型のサイトカインが産生された。インバリアント鎖はエンドゾーム系への移行シグナルを持つためMHCクラスII分子へのT細胞エピトープの結合を助けると考えられており、このDNAワクチンによってアレルゲンに対するT細胞応答のみが誘導されたことが示唆された(坂口)。
結論
1.粘膜ワクチンの有効性の免疫学的基礎の解析。1)CTB* 併用ワクチンを経鼻投与した場合にワクチンに対する特異免疫応答が増強される理由は、CTB*が自然免疫系(非特異的にウイルス増殖を抑制する)に作用することによって動き出したサイトカインの一つであるIL-1が、ワクチンに特異的な免疫応答を増強することによる(田村)。2)インフルエンザウイルスが粘膜の上皮細胞に感染し、増殖をしながら隣接する細胞に感染を拡大していく過程で、感染細胞の破壊や上皮の剥離が起こると共に上皮下に顆粒球が浸潤し(感染後2-3日)、やがて上皮の修復のための重層化がはじまる(感染後4-5日)。感染5日目頃から免疫組織化学的にIgA陽性細胞がNALTの近傍に多く観察されるようになり、感染7日目ピークになる。産生分泌されたIgA抗体は増殖途上のウイルスを中和し、感染細胞は感染10日目頃には検出されなくなる(岩崎)。3)粘膜免疫の実行組織であるNPには3/5のB1型と2/5のB2型のIgA抗体産生B細胞がおり、B2型が大多数の粘膜免疫の誘導組織であるNALTとはB細胞の分布が異なっていた。この事実は、B1がNALTとは独立に発生する可能性を示唆している。
2.新しい粘膜ワクチンの開発。1)大腸菌易熱性毒素(LT)の変異LT 44HAは、E. coliの培養系において収量が多いことから、ヒトでの経鼻インフルエンザワクチンのアジュバントとしての有用性が検討された。しかしながら、既に経鼻ワクチンのアジュバントとしてヒトでの有効性が確認されている1%LT添加ITB(LTB*)に比較して免疫増強効果が多少低かった(田村)。2)経鼻う蝕ペプチドワクチン用の抗原として、う蝕病原菌の初期付着因子(PAc)の生物活性阻害抗体のみを誘導できる最小単位のペプチド(13残基)の3量体を直列連結し連結部のスペーサーにリジンダイマーを用いたものが最も有力と考えられる(西沢)。3)病原性大腸菌O157のVerotoxin 1(VT1)のエピトープを組み込んだ乳酸菌Lactococcus lactis IL1403を経口投与されたマウスにおいて、誘導されたVT1に特異的な抗体が防御抗体として働くかどうかが検討されねばならない(五十君)。
3.粘膜アレルギー抑制機構の解析。1)Cryj1のT細胞エピトープとインバリアント鎖の遺伝子を融合したcDNAをpCAGGSプラスミドに組み込み、これを筋肉内に免疫したマウスにおいて、アレルゲン特異的なIgE抗体産生が抑制された(坂口)。
2.新しい粘膜ワクチンの開発。1)大腸菌易熱性毒素(LT)の変異LT 44HAは、E. coliの培養系において収量が多いことから、ヒトでの経鼻インフルエンザワクチンのアジュバントとしての有用性が検討された。しかしながら、既に経鼻ワクチンのアジュバントとしてヒトでの有効性が確認されている1%LT添加ITB(LTB*)に比較して免疫増強効果が多少低かった(田村)。2)経鼻う蝕ペプチドワクチン用の抗原として、う蝕病原菌の初期付着因子(PAc)の生物活性阻害抗体のみを誘導できる最小単位のペプチド(13残基)の3量体を直列連結し連結部のスペーサーにリジンダイマーを用いたものが最も有力と考えられる(西沢)。3)病原性大腸菌O157のVerotoxin 1(VT1)のエピトープを組み込んだ乳酸菌Lactococcus lactis IL1403を経口投与されたマウスにおいて、誘導されたVT1に特異的な抗体が防御抗体として働くかどうかが検討されねばならない(五十君)。
3.粘膜アレルギー抑制機構の解析。1)Cryj1のT細胞エピトープとインバリアント鎖の遺伝子を融合したcDNAをpCAGGSプラスミドに組み込み、これを筋肉内に免疫したマウスにおいて、アレルゲン特異的なIgE抗体産生が抑制された(坂口)。
公開日・更新日
公開日
-
更新日
-