文献情報
文献番号
199900441A
報告書区分
総括
研究課題名
炭疽菌の発症機構の解明と迅速検出法の確立(総括研究報告書)
課題番号
-
研究年度
平成11(1999)年度
研究代表者(所属機関)
牧野 壮一(帯広畜産大学)
研究分担者(所属機関)
- 藤原真一郎(国立公衆衛生院)
- 倉園久夫(岡山大学)
研究区分
厚生科学研究費補助金 先端的厚生科学研究分野 新興・再興感染症研究事業
研究開始年度
平成11(1999)年度
研究終了予定年度
平成13(2001)年度
研究費
20,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
炭疽菌により起こる炭疽は、草食動物を中心とした家畜伝染病であるが、人を含めた他の動物にも重篤な症状を起こす人畜共通伝染病である。炭疽菌は、乾燥状態で容易に芽胞菌となり、一度土壌が炭疽菌で汚染されると、芽胞菌として感染力を保持しながら数十年生残し、炭疽常在地となる。人の疾病は、創傷感染による皮膚炭疽、汚染動物肉の経口摂取による腸炭疽、および芽胞を吸引する肺炭疽があるが、肺炭疽が最も死亡率が高い。そして、炭疽菌の芽胞は、容易にに大量培養でき、しかも無味無臭の粉末として調整でき、容易に生物兵器へ利用される危険性がある。即ち、炭疽は世界で食肉衛生・防疫上最も恐れられている伝染病の一つである。我国での炭疽の発生報告はこの数年無いが、国外では数多く発生している。かつて我国でも炭疽は頻繁に発生したので、土壌の炭疽菌常在化が既に起こっていると考えられ、常に内外から我国は危険にさらされているといえる。しかし、国外で危険視されている炭疽に対する我国の関心は、極めて低い。更に、ワクチンの不備や、炭疽の早期診断技術の確立の不十分さなどの問題点が多く残っている。そこで、本研究では、炭疽に対する国内での発生を未然に防止するために、土壌や不顕性感染動物からの迅速・確実な検出法および国外からの炭疽の伝播に対して未然に防ぐために必要な防疫上の検査法の確立、しいては予防のための基礎データとなる炭疽の発症機構の解明などを行い、炭疽から社会を守るために炭疽の基礎および応用研究を行う。同時に、炭疽が発生した場合に備え、その感染経路を的確に把握するための炭疽菌の遺伝子型別を行う基礎データを作成することも研究目標としている。
研究方法
使用菌株はバシラス属の内炭疽菌が9株、炭疽菌以外が27株、バシラス属以外55株を用いて、PCRおよびPLET培地(WHO推薦のハートインフュージョン寒天培地に酢酸タリウム、ポリミキシンB、lyzosymeを添加した炭疽菌用の選択培地)の炭疽菌への特異性を調べた。PCRはNested-PCR法によった。プライマーは毒素遺伝子用のファーストプライマーが、PA5とPA8で596bpの増幅を、セカンドプライマーがPA6とPA7で210bpの増幅を行う。莢膜遺伝子用はファーストプライマーが、MO11とMO12で592bpの増幅を、セカンドプライマーがBA546とBA547で298bpの増幅を行う。炭疽菌染色体用はファーストプライマーが、BA813UとBA813Lで254bpの増幅を、セカンドプライマーがBA813R1とBA813R2で152bpの増幅を行う。PCRの条件は95℃15秒、55℃30秒72℃60秒を1サイクルとして35サイクル行った。増幅産物はアガロースゲル電気泳動により確認した。鋳型DNAは、各菌株より通常の方法で全DNAを分離精製し、使用した。食肉検査所から採材した豚のリンパ節や土壌に人工的に炭疽菌芽胞を0、1、10、および100個を添加して(土壌では1000この添加も行った)実験を行った。その際、炭疽菌はパスツール2苗の芽胞液を用いた。炭疽菌を添加した検体は適当に希釈して、PLET培地および血液寒天平板に塗抹して直接炭疽菌を分離した。PCR法のための検体処理は、芽胞を添加したリンパ節1gを10mlのトリプトケース液体培地(TSA)と混合し、37℃で16時間振盪培養を行う。土壌の場合、芽胞を添加した土壌10gを100mlのTSAと混合し、70℃30分加熱後、37℃で16時間振盪培養を行う。翌朝それらの一次増菌培養液の0.1mlを10mlのTSAに加え、更に6時間37℃で振盪培養した。その培養液1.0mlを遠心後、滅菌水で2回洗浄し、通常のファーノール/SDS法で全DNAを分離精製した。又、炭疽の発症機構を解明するために、炭疽菌表層に形成される高分子量の莢膜を低分子化するのに必須の
dep遺伝子の変異株を用いてマウスへの病原性を調べ、同時に遺伝子の発現調節をノザンハイブリ法により調べた。
dep遺伝子の変異株を用いてマウスへの病原性を調べ、同時に遺伝子の発現調節をノザンハイブリ法により調べた。
結果と考察
PCR反応は炭疽菌にのみ特異的であった。また、炭疽菌は全てPLET培地上で、通常通りに発育した。しかし、他の株はB. licheniformis一株を除いてPLET培地上には発育しなかった。サンプルからの炭疽菌の直接分離は、1gのリンパ節に10個以上、10gの土壌に1000個以上存在すれば可能であった。しかし、増菌操作を併用したPCR法ではリンパ節1gに1個炭疽菌があれば、炭疽菌DNAの検出が可能であった。一次培養液を用いた場合と、二次培養液を用いた場合、そして一次PCRと二次PCRを用いた場合を比較すると、含有菌量が多ければ、両者の一次で十分検出可能であった。又、更に菌量が多ければ、臓器を直接PCRに用いることも可能であった。しかし、土壌からは、炭疽菌DNAを検出できたこともあったが、全く増幅産物が確認できないこともあった。同様に、最終DNAの純度にもバラつきがあった。また、dep遺伝子の変異株はマウスに対して病原性が喪失していた。dep遺伝子は、莢膜形成遺伝子群と同じ転写単位で制御され、炭酸ガス存在下で発現が増幅されることが分かった。同時に、菌体外に放出された低分子の莢膜物質がdep遺伝子変異株の病原性の喪失をある程度回復させることが分かり、この回復は補体の添加による抑制されることが分かった。本研究でデザインしたプライマーは炭疽菌特異的であり、実際の検出には使用できるものと考えられたが、菌体そのものを炭疽菌かどうか判定するには、ミックスプライマーセットの利用が有益であると考えられ、毒素と莢膜遺伝子検出用プライマーを同時に用いるのが便利であろう。これは、実際の現場へすでに応用されている。一方、PLET培地はWHOで推薦する炭疽菌選択培地である。分離同定された菌株を用いて行った結果では、一株だけPLET培地上で発育したが、炭疽菌は全て通常の発育を示した。実際の検体にも応用可能ではないかと考えている。炭疽菌をリンパ節から直接分離することは、1g当り10個以上存在すれば、通常の条件で可能であった。しかし、菌数が少ない場合は、多分増菌過程を経る必要があるものと考えられる。一方、迅速診断法としてのPCR法の利用は、1g当り1個の菌でも検出可能であり、現行の方法に比較して迅速性に優れていた。菌量が多い場合は、直接検出も可能であろう。しかし、更なる迅速診断法が必要であり、その場で判定という方法を確立する必要があろう。一方、土壌から直接分離することは、余程の菌数の汚染が無い限り不可能であると考えられた。同時に、直接PCRを行ったが、土壌の種々の含有物の持ち込みが原因なのか不明だが、成功していない。迅速検出という観点でPCR法を応用したが、条件によって全く結果が異なってしまい、前培養条件とサンプル処理の改善が今後の課題である。
結論
炭疽菌の汚染を迅速に検出する方法の予備試験として、デザインしたプライマーの特異性および選択培地の有効性を調べた。結果として、炭疽菌への応用が可能であると結論できた。また、今回、食肉から迅速かつ的確に炭疽菌を検出する系を確立した。しかし、問題点は、翌日判定であるという点であり、更なる迅速化が必要であった。炭疽菌の汚染を迅速に検出する方法として、土壌に関して確立を目指した。しかし、結果は一定せず、更なる条件検定が必要であると結論できた。同時に、炭疽菌の分離が最終的には必須であるが、直接分離はほとんど不可能であり、何らかのトリックが必要であろう。また、炭疽の発症機構は莢膜形成に関しては、宿主免疫機構からの逃避という形で関与しており、感染症の防御を考えると、毒素を利用したワクチン開発が必須であると考えられた。
公開日・更新日
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