文献情報
文献番号
199900380A
報告書区分
総括
研究課題名
パーキンソン病における神経細胞死の分子機構とその保護治療に関する研究
課題番号
-
研究年度
平成11(1999)年度
研究代表者(所属機関)
永津 俊治(藤田保健衛生大学総合医科学研究所)
研究分担者(所属機関)
- 水野美邦(順天堂大学医学部)
- 小川紀雄(岡山大学医学部分子細胞医学研究施設)
- 久野貞子(国立療養所宇多野病院臨床研究部)
研究区分
厚生科学研究費補助金 先端的厚生科学研究分野 脳科学研究事業
研究開始年度
平成10(1998)年度
研究終了予定年度
平成12(2000)年度
研究費
64,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
本研究は、パーキンソン病の原因を分子レベルで解明し、ドーパミンニューロンの変性を予防阻止しあるいはドーパミンニューロンを保護する治療法を開発することを目的としている。パーキンソン病の病態が解明され、病気の進行を抑制することが可能になれば、患者本人のQuality of Life (QOL)を改善するだけでなく、看護する家族の負担を減らし、結果として医療経済上の大きいメリットを生ずることが期待される。
研究方法
パーキンソン病死後脳について、神経栄養因子BDNFとNGF、およびapoptosis経路上流のTNF-_ receptor 1 (TNF-R1, p55)量を高感度酵素免疫測定法によって測定した。Caspase 1およびcaspase 3の酵素活性は、acetyl-Tyr-Val-Ala-Asp-_-(4-methyl-coumaryl-7-amide)と acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-_-(4-methyl-coumaryl-7-amide)を基質として遊離する7-amino-4-methyl-coumarinを、蛍光測定した。劣性遺伝・家族性パーキンソン病の原因遺伝子parkinの産物Parkinタンパク質に対する抗体を作製して免疫組織化学で死後脳のParkinタンパク質の存在を検索した。Western blottingは、対照脳の前頭葉・線条体・黒質のホモジネート、および前頭葉の可溶性画分・Golgi画分・ミトコンドリア画分・マイクロソーム画分・核画分について行った。8-oxo-dGTPaseおよび8-oxo-dGの免疫組織化学的検索は、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体を用いて行った。NG108-15細胞株を用いた過酸化水素による酸化的ストレスによる神経細胞死評価法を確立してイムノフィリンリガンドの細胞死抑制効果を検索した。6-OH-ドーパミン(60 _g/2 _l)をICR系雄性マウスの右側脳室内に単回投与して、酸化ストレスに基づく細胞障害の指標として、過酸化脂質量(TBA-RS)量、ドーパミンとその代謝物質を測定した。脳内酸化ストレス消去系の指標として、superoxide dismutase (SOD)とcatalaseの活性およびglutathione量を測定した。神経細胞の保護に働くアストログリア細胞からの神経栄養因子の分泌を培養上清中のNGF, BDNF, GDNFを酵素免疫測定法で測定した。MPTPパーキンソン病サルでMPTPを静脈内注射して、脳のGDNFとチロシン水酸化酵素の免疫陽性神経細胞の数を計測した。
結果と考察
パーキンソン病死後脳で神経栄養因子の変化を検討した。その結果、パーキンソン病死後脳で黒質線条体部位に特異的にBDNFとNGFが著明に減少することを見出した。BDNFはヒト脳で濃度が高く、ng/mg proteinのレベルであった。正常対照脳でのBDNFの脳内分布は、尾状核>被殻>黒質>小脳≒大脳の順であり、線条体(尾状核と被殻)・黒質において濃度が高かった。BDNFはパーキンソン病線条体(尾状核、被殻)と黒質で、対照脳の20～50%のレベルまで著明に減少した。しかし大脳と小脳ではBDNF濃度の有意な変化は認められなかった。対照脳でNGFは濃度が低くpg/mg proteinのレベルであった。黒質での濃度は大脳より低かったが、パーキンソン病の黒質でNGF濃度が対照脳の約3%まで高度に減少することを見出した。BDNFやNGFなどの神経栄養因子の減少は酸化的ストレスに対する抵抗性を減少させapoptosisを促進する。次に、apoptosis経路の最初に位置するTNF-R1 (p55)量をパーキンソン病死後脳で酵素免疫測定法により定量した。対照脳ではTNF-R1は脳の各部位で等しく分布しており、約100 pg/mg proteinであった。TNF-R1はパーキンソン病死後脳の黒質、被殻、尾状核において、部位特異的に対照脳の約2倍に増加していた。ついでapoptosis経路の下流に位置するcaspase 1とcaspase 3の活性をパーキンソ
ン病死後脳で測定した。両酵素ともに対照脳で脳内分布はほぼ等しく、約2 _mol AMC/hr/mg protein (37℃)であった。Caspase 1活性は黒質で平均152%と有意に増加していた。Caspase 3活性は黒質で185%とcaspase 1よりもさらに著明に増加していた。Caspase 3はapoptosisの最終段階と推定されている。劣性遺伝・家族性パーキンソン病の原因遺伝子parkinの産物であるParkinタンパク質の脳内分布を孤発型パーキンソン病脳と対照脳について、免疫組織化学により検索した。前頭葉、線条体、中脳の全ての神経細胞で免疫反応が認められたが、グリア細胞での発現は低かった。パーキンソン病で変性をおこす黒質緻密部有メラニン色素神経細胞での発現が最も強かった。細胞体と突起が染色されたが、核は染色されなかった。パーキンソン病黒質のLewy小体も染色されるものがあり、ユビキチン及び_-synucleinとの共存が二重染色で示された。Western blottingで対照脳前頭葉では、Parkinタンパク質はGolgi装置と可溶性画分に存在し、核とミトコンドリア画分には存在しなかった。対照患者では黒質に最も発現が多かった。parkin遺伝子に変異を有する家族性パーキンソン病ではParkinタンパク質の発現がないことが免疫染色とWestern blottingで確認された。孤発型パーキンソン病の黒質では、対照に比べてParkinタンパク質が減少していたが、神経細胞の数の減少を反映している可能性がある。孤発型パーキンソン病脳では、8-oxo-dGTPase及び8-oxo-dGの免疫染色は大部分の黒質ニューロメラニン含有細胞が陽性であったが、対照脳では陽性細胞は10%以下であった。また8-oxo-dGは核は染色されず、細胞質が染色されたので、主にミトコンドリアDNAが酸化的障害を被っていると考えられる。対照脳、多系統萎縮脳では、8-oxo-dGTPase及び8-oxo-dGは免疫染色でもWestern blottingでも増加が認められなかった。従って黒質神経細胞のミトコンドリアDNAの酸化障害はパーキンソン病に特異的と考えられる。NG108-15細胞株を用いたH2O2による神経細胞死評価系で、H2O2の添加により、細胞生存率は濃度依存的に低下し、IC50は500 _Mであった。イムノフィリンリガンドのFK506もGPI1046も、あらかじめ添加して培養した後にH2O2を添加して培養すると細胞生存率を有意に改善した。6-OH-ドーパミン脳室内投与による脳内酸化ストレス消去系の変化を、脂質過酸化反応の指標であるTBA-RS量、glutathione含量、catalase活性、SOD活性の変化によって検索した。Glutathione量は脳室内投与後3-14日後有意に低下し、28日には一過性に上昇し、56日に正常レベルにもどった。Catalase活性とSOD活性はそれぞれ28日後と7日後に一過性の上昇を示した。イムノフィリンリガンドのFK506またはGPI1046の連続投与で線条体glutathione量は用量依存的に増加した。6-OH-ドーパミン脳室内投与によるin vivoパーキンソン病モデルでFK506もGPI1046も線条体におけるドーパミン量の減少を有意に改善した。MPTPパーキンソン病サルで、黒質におけるチロシン水酸化酵素陽性ドーパミン神経細胞数とGDNF陽性神経細胞数の変化を、経時的にしらべたところ、黒質神経細胞死の機序にはGDNFの減少が先行関与していることを示唆された。パーキンソン病治療薬であるドーパミンアゴニストapomorphineは、培養アストログリア細胞でNGFの分泌量を122倍に、GDNFの分泌量を1.8倍に増加させた。さらに細胞内のNGF mRNAとGDNF mRNAも有意に増加した。この成績はapomorphineはドーパミン欠乏の補充と共に神経栄養因子のNGF・GDNFを増加させて神経保護効果をもつことを示した。
ン病死後脳で測定した。両酵素ともに対照脳で脳内分布はほぼ等しく、約2 _mol AMC/hr/mg protein (37℃)であった。Caspase 1活性は黒質で平均152%と有意に増加していた。Caspase 3活性は黒質で185%とcaspase 1よりもさらに著明に増加していた。Caspase 3はapoptosisの最終段階と推定されている。劣性遺伝・家族性パーキンソン病の原因遺伝子parkinの産物であるParkinタンパク質の脳内分布を孤発型パーキンソン病脳と対照脳について、免疫組織化学により検索した。前頭葉、線条体、中脳の全ての神経細胞で免疫反応が認められたが、グリア細胞での発現は低かった。パーキンソン病で変性をおこす黒質緻密部有メラニン色素神経細胞での発現が最も強かった。細胞体と突起が染色されたが、核は染色されなかった。パーキンソン病黒質のLewy小体も染色されるものがあり、ユビキチン及び_-synucleinとの共存が二重染色で示された。Western blottingで対照脳前頭葉では、Parkinタンパク質はGolgi装置と可溶性画分に存在し、核とミトコンドリア画分には存在しなかった。対照患者では黒質に最も発現が多かった。parkin遺伝子に変異を有する家族性パーキンソン病ではParkinタンパク質の発現がないことが免疫染色とWestern blottingで確認された。孤発型パーキンソン病の黒質では、対照に比べてParkinタンパク質が減少していたが、神経細胞の数の減少を反映している可能性がある。孤発型パーキンソン病脳では、8-oxo-dGTPase及び8-oxo-dGの免疫染色は大部分の黒質ニューロメラニン含有細胞が陽性であったが、対照脳では陽性細胞は10%以下であった。また8-oxo-dGは核は染色されず、細胞質が染色されたので、主にミトコンドリアDNAが酸化的障害を被っていると考えられる。対照脳、多系統萎縮脳では、8-oxo-dGTPase及び8-oxo-dGは免疫染色でもWestern blottingでも増加が認められなかった。従って黒質神経細胞のミトコンドリアDNAの酸化障害はパーキンソン病に特異的と考えられる。NG108-15細胞株を用いたH2O2による神経細胞死評価系で、H2O2の添加により、細胞生存率は濃度依存的に低下し、IC50は500 _Mであった。イムノフィリンリガンドのFK506もGPI1046も、あらかじめ添加して培養した後にH2O2を添加して培養すると細胞生存率を有意に改善した。6-OH-ドーパミン脳室内投与による脳内酸化ストレス消去系の変化を、脂質過酸化反応の指標であるTBA-RS量、glutathione含量、catalase活性、SOD活性の変化によって検索した。Glutathione量は脳室内投与後3-14日後有意に低下し、28日には一過性に上昇し、56日に正常レベルにもどった。Catalase活性とSOD活性はそれぞれ28日後と7日後に一過性の上昇を示した。イムノフィリンリガンドのFK506またはGPI1046の連続投与で線条体glutathione量は用量依存的に増加した。6-OH-ドーパミン脳室内投与によるin vivoパーキンソン病モデルでFK506もGPI1046も線条体におけるドーパミン量の減少を有意に改善した。MPTPパーキンソン病サルで、黒質におけるチロシン水酸化酵素陽性ドーパミン神経細胞数とGDNF陽性神経細胞数の変化を、経時的にしらべたところ、黒質神経細胞死の機序にはGDNFの減少が先行関与していることを示唆された。パーキンソン病治療薬であるドーパミンアゴニストapomorphineは、培養アストログリア細胞でNGFの分泌量を122倍に、GDNFの分泌量を1.8倍に増加させた。さらに細胞内のNGF mRNAとGDNF mRNAも有意に増加した。この成績はapomorphineはドーパミン欠乏の補充と共に神経栄養因子のNGF・GDNFを増加させて神経保護効果をもつことを示した。
結論
パーキンソン病の黒質線条体ドーパミンニューロンの神経細胞死のapoptosis仮説を立証する成績が明らかになってきているので、この発症機序をさらに詳細に解明すると同時に、apomorphineのような神経栄養因子を増加させる薬剤、イムノフィリンリガンド、caspase阻害薬など、apoptosis経路を阻害して、神経保護修復作用のある薬剤の開発の研究を進めていく。
公開日・更新日
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