文献情報
文献番号
199900369A
報告書区分
総括
研究課題名
ヒトゲノム研究に基づく腫瘍免疫細胞療法の開発研究(総括研究報告書)
課題番号
-
研究年度
平成11(1999)年度
研究代表者(所属機関)
平井 久丸(東京大学医学部附属病院)
研究分担者(所属機関)
- 十字猛夫(日本赤十字社中央血液センター)
研究区分
厚生科学研究費補助金 総合的プロジェクト研究分野 ヒトゲノム・遺伝子治療研究事業
研究開始年度
平成11(1999)年度
研究終了予定年度
平成13(2001)年度
研究費
60,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
慢性骨髄性白血病(CML)細胞はbcr/ablキメラ蛋白を発現するが、その切断点を含むペプチドは腫瘍特異的であり腫瘍拒絶抗原となりうる。この抗原特異的な細胞障害性T細胞(CTL)は、白血病細胞のみを傷害し他の正常細胞は傷害しないため副作用のない、効果的な免疫療法として期待される。CML細胞は、そのほとんどがbcr/ablキメラ遺伝子をもち、その発現する蛋白は白血病細胞の増殖に必須である。しかも切断点を含むペプチドは腫瘍特異的であり腫瘍抗原となりうる。我々は、CMLに対する樹状細胞を用いた免疫療法を開発することを目的として、CML患者末梢血においてbcr/ablペプチド特異的T細胞の誘導が可能か否かと、またその誘導がbcr/ablの切断点の型及びHLAの型に依存するかについて基礎的検討を行った。これらの検討を基礎に、CML患者に対しbcr/ablペプチドをパルスした自己樹状細胞を投与する臨床試験の安全性と有効性に関しての検討を行った。
研究方法
約30名のCML患者のbcr/ablの切断点の型、及びHLA型を調べ、患者末梢血より抗CD14抗体ビーズを用いて単球を回収し、メディウムにIL-4とGM-CSFを加えて樹状細胞化させた。17merのbcr/ablペプチドを加え、同じ患者のリンパ球と混合培養を行った。ペプチドをパルスした樹状細胞による刺激は7ー10日間隔で繰り返した。2回目の刺激後、抗CD4/CD8抗体ビーズを用いてCD4陽性T細胞とCD8陽性T細胞に分離した。5回以上刺激した後、樹立したT細胞のペプチドに対する反応性を樹状細胞を用いた系により3H-thymidineの取り込みや51Cr遊離試験による評価を行い、得られたT細胞の解析を行った。これらの基礎検討に基づき、当院倫理委員会の承認のもとにCMLに対する樹状細胞を用いた細胞療法の臨床試験を行った。対象は、CML患者で病期は問わず、骨髄移植ができず、インターフェロンが無効、あるいは副作用で使えない患者とした。また、重篤な臓器障害、肝炎等の感染のある患者は除外した。bcr/ablの切断点がb3a2型で、HLA型がA*0201またはA*2402を持つ患者とした。以上に該当した3名のCML患者において、治療の説明をし同意を得た上で、樹状細胞療法を行った。方法は患者末梢血よりアフェレーシスにて10Lを処理し、Ficollにて単核球を分離。続いて50%Percollにて単球分画を除きAIMメディウム+10%自己血清にて培養。翌日、15%メトリザマイドにて比重遠心分離を行い、樹状細胞分画を回収する。これにbcr/ablペプチドまたコントロールとしてKLH蛋白をパルスし培養する。翌日、14%メトリザマイドにて比重遠心分離を行い樹状細胞分画を回収しPBSにて洗浄後、採取から48時間後に患者に静注にて戻した。以上を2週間隔で計4回施行した。副作用は理学所見、検査所見等で評価した。免疫学的な評価としては、治療前及び治療後4週毎に bcr/ablペプチドあるいはコントロールとしてのKLH蛋白をパルスした樹状細胞を患者皮内に接種し遅延型過敏反応(DTH)試験を調べた。また、患者末梢血T細胞の治療による変化を観察するために末梢血T細胞クローナリティーをRT-PCR-SSCP法で解析した。これは、患者末梢血より単核球を分離し更にRNAを抽出する。これに逆転写酵素を加えcDNAとし、T細胞レセプター(TCR)βの可変部と定常部にプライマーを設定しCDR3領域を含む部分のPCRを行い、更にこのPCR産物をSSCP法で泳動することによりTCR Vβ毎のクローナリティを調べた。また臨床評価としては骨髄におけるPh+染色体の割合の推移、bcr/abl FISHの陽性率の推移による評価等を行った。
結果と考察
b3a2型bcr/ablペプチドに特異的に反応するCD8陽性T細胞を樹立した。HLA型ではA*0201及びA*2402を持つ患者で樹立
できた。b2a2型bcr/ablペプチドに特異的に反応するCD8陽性T細胞は樹立できなかった。樹立されたCD8陽性T細胞はbcr/ablペプチド添加自己樹状細胞に対し細胞障害活性を示した。同種樹状細胞に対しbcr/ablペプチド添加し細胞障害活性を検討したところクラスI拘束性にbcr/ablペプチド特異的な細胞障害活性であることが示唆された。非特異的な細胞障害活性はほとんど認められなかった。樹立されたCD8陽性T細胞は、いづれもb3a2型bcr/ablで特定のHLAに対するものであり、bcr/abl特異的CTLの誘導はbcr/ablの転座点の型とHLAに大きく影響されることが示唆された。3例のCML患者に対する樹状細胞療法では、アフェレーシスに問題はみられなかった。アフェレーシスによりCML患者においても樹状細胞が得られることがわかったが、その数は健常人にて予想される数に比し少なかった。投与した樹状細胞量は1回あたり1 x 105 - 5 x 106個であった。治療による免疫学的な反応では、治療開始8週後頃よりKLHあるいはbcr/ablペプチドに対するDTH反応が一部認められたが何れも一過性であり24週後までにはいずれも消失した。また、RT-PCR-SSCPの結果、クローナルなT細胞の集積の出現あるいは消失が治療後の一部症例において考えられた。治療による臨床的効果に関しては、一部症例においてはFISHにおいて一過性にbcr/abl陽性細胞の割合の減少を認めた。しかし、染色体レベルでは明らかな腫瘍クローンの減少効果は認められなかった。CML患者に対し、今後樹状細胞を用いて治療効果をあげていくためには、樹状細胞のソースとして末梢血中に十分量存在する単球を用いることの検討が必要と思われる。単球をGM-CSFとIL-4で数日間培養すると樹状細胞用の機能を持つことが知られており、これを用いることにより樹状細胞の数の問題は解決できる。今後は樹状細胞のソースを代え投与量、投与回数を増やす、IL-2等のサイトカインを組み合わせる、in vitroで増やした抗原特異的CTLを投与するなどの方法を検討し、治療効果をより増強させる方法論の開発を目指す予定である。また今回の臨床試験では、1例の患者で細胞輸注時に悪寒、発熱がみられたが、他に副作用は認められなかった。残りの2例の患者は何れも副作用は現在までに認められていない。副作用として自己抗体の出現が報告されているが、今回の我々の治療に関してはこれら自己抗体の出現は認められなかった。世界的にも治療の副作用で慢性関節リウマチを発症したとする一例報告がある以外は重篤な副作用、合併症は報告されておらず、樹状細胞療法は比較的安全な治療であると考えられる。特に我々の場合は、抗原として腫瘍特異的なペプチドを用いているため安全性は高いと思われる。
できた。b2a2型bcr/ablペプチドに特異的に反応するCD8陽性T細胞は樹立できなかった。樹立されたCD8陽性T細胞はbcr/ablペプチド添加自己樹状細胞に対し細胞障害活性を示した。同種樹状細胞に対しbcr/ablペプチド添加し細胞障害活性を検討したところクラスI拘束性にbcr/ablペプチド特異的な細胞障害活性であることが示唆された。非特異的な細胞障害活性はほとんど認められなかった。樹立されたCD8陽性T細胞は、いづれもb3a2型bcr/ablで特定のHLAに対するものであり、bcr/abl特異的CTLの誘導はbcr/ablの転座点の型とHLAに大きく影響されることが示唆された。3例のCML患者に対する樹状細胞療法では、アフェレーシスに問題はみられなかった。アフェレーシスによりCML患者においても樹状細胞が得られることがわかったが、その数は健常人にて予想される数に比し少なかった。投与した樹状細胞量は1回あたり1 x 105 - 5 x 106個であった。治療による免疫学的な反応では、治療開始8週後頃よりKLHあるいはbcr/ablペプチドに対するDTH反応が一部認められたが何れも一過性であり24週後までにはいずれも消失した。また、RT-PCR-SSCPの結果、クローナルなT細胞の集積の出現あるいは消失が治療後の一部症例において考えられた。治療による臨床的効果に関しては、一部症例においてはFISHにおいて一過性にbcr/abl陽性細胞の割合の減少を認めた。しかし、染色体レベルでは明らかな腫瘍クローンの減少効果は認められなかった。CML患者に対し、今後樹状細胞を用いて治療効果をあげていくためには、樹状細胞のソースとして末梢血中に十分量存在する単球を用いることの検討が必要と思われる。単球をGM-CSFとIL-4で数日間培養すると樹状細胞用の機能を持つことが知られており、これを用いることにより樹状細胞の数の問題は解決できる。今後は樹状細胞のソースを代え投与量、投与回数を増やす、IL-2等のサイトカインを組み合わせる、in vitroで増やした抗原特異的CTLを投与するなどの方法を検討し、治療効果をより増強させる方法論の開発を目指す予定である。また今回の臨床試験では、1例の患者で細胞輸注時に悪寒、発熱がみられたが、他に副作用は認められなかった。残りの2例の患者は何れも副作用は現在までに認められていない。副作用として自己抗体の出現が報告されているが、今回の我々の治療に関してはこれら自己抗体の出現は認められなかった。世界的にも治療の副作用で慢性関節リウマチを発症したとする一例報告がある以外は重篤な副作用、合併症は報告されておらず、樹状細胞療法は比較的安全な治療であると考えられる。特に我々の場合は、抗原として腫瘍特異的なペプチドを用いているため安全性は高いと思われる。
結論
CML患者の末梢血より樹状細胞を用いてbcr/abl特異的T細胞を樹立することに成功した。樹状細胞を用いた免疫療法をCMLに対して臨床応用することが可能であると考え、CML患者に対し樹状細胞療法を行った。副作用は少なく安全であったが、治療効果は限局的であった。今後、治療法の改善などについて、さらに検討する必要がある。
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