文献情報
文献番号
199900338A
報告書区分
総括
研究課題名
老化疾患モデルマウスを用いた成人病に関連する遺伝子の同定と病態の解明
課題番号
-
研究年度
平成11(1999)年度
研究代表者(所属機関)
鍋島 陽一(京都大学大学院医学研究科教授)
研究分担者(所属機関)
- 藤森俊彦(京都大学大学院医学研究科助手)
- 吉田松生(京都大学大学院医学研究科助手)
- 星野幹雄(京都大学大学院医学研究科助手)
研究区分
厚生科学研究費補助金 総合的プロジェクト研究分野 ヒトゲノム・遺伝子治療研究事業
研究開始年度
平成10(1998)年度
研究終了予定年度
平成12(2000)年度
研究費
25,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
高齢化社会を迎え加齢や生活習慣に伴う疾患が増大し、国民医療費の高騰と高齢者の健康な生活を脅かしていることから成人病に対する研究の推進は急務となっている。一方、ゲノム研究の進展により遺伝子の発現や機能異常を基盤として多くの疾患が成立していること、また、疾病の発症には多数の遺伝的素因が関連していることが示唆されており、遺伝子機能を基礎として疾患を理解し、治療法や遺伝子診断などの対策をたてることの重要性が浮かび上がっている。そこで、本研究では「新たな成人病関連遺伝子の分離、同定」及び「発生工学を利用した病態解析とヒト疾患モデル動物の作製」を目的として、以下の研究を行った。(1)成人病や加齢にともって発症する疾患との関連が推定される遺伝子のノックアウトマウスを作成し、病態解析に結び付ける。(2)多彩な老化症状を示すKlotho変異マウスをモデルとして、老化関連症状の成り立ちに関与する遺伝子、発症や症状の強さに関連する遺伝子素因について、新しい方法の開発を含めて検討する。
研究方法
klotho遺伝子のエクソン1のATGコドンの下流にlaxZ, Neo遺伝子をノックインしたマウスを作成した。このマウスはklotho遺伝子のnull変異でもあるので、変異表現型の解析とlaxZ遺伝子の発現の両方を解析した。Limkinase 1はヒトにおいて精神、記憶、学習などの障害に関連することが報告されていることから、LimKinase 2とのダブルノックアウトマウスを作成し、発生、脳の形態、機能にちて解析した。プレセニリン結合蛋白、STEF1, Klothoホモログ(b-klotho)については、染色体遺伝子を分離し、相同組み換えベクターを作製し、相同組み換え細胞を分離し、ノックアウトマウスの作成を進めている。カルシウム、リンの血中、尿中濃度が顕著に上昇しており、食餌制限によりこれらの濃度を制御することを試みた。関連する遺伝子を網羅的に解析するために、Klothoマウスおよび野生型マウスの腎臓よりmRNAを調製し、DNAアレイを利用して発現が変化しているmRNAを解析した。発症の遺伝子素因を解析する目的で、遺伝的背景が異なる実験室マウスとKlothoマウスを掛け合わせ、変異表現型を解析し、その差異を検討した。klotho遺伝子の遺伝子多型を調べ、リンクする疾患や症状を解析した。マウス脳よりRT-PCR法を用いて、sif遺伝子のマウスホモログstefをクローニングした。in situ ハイブリダイゼーションにより、各発生段階の中枢神経系における発現様式を調べた。STEFがどのG蛋白質のGEFとなっているのかをin vitroの生化学的アッセイで調べた。同時にラッフリング膜形成の誘導を観察した。Rac1のドミナントネガティブ体の共発現により上記現象の抑制を観察した。いろいろなドメインを欠失したSTEF蛋白質をKB細胞に強制発現させ、STEF蛋白質が細胞膜領域への局在、ラッフリング膜形成を観察した。STEF、あるいはドミナントネガティブ体(PHnTSS)を強制発現し、神経突起伸長を観察した。
結果と考察
加齢関連疾患研究の飛躍的な進歩のためには、多くの関連遺伝子の同定と機能解析を必要としている。本研究では発生工学を利用した病態解析とヒト疾患モデル動物の作製を目的として、klotho遺伝子座にlaxZ遺伝子をノックインしたマウス、プレセニリン結合蛋白、STEF1, Limkinase1などの神経疾患に関連する新たな遺伝子、及びKlothoホモログのノックアウトマウスの作成を試み、その変異表現型を解析した。klotho遺伝子座にlaxZ遺伝子をノックインしたマウスの解析によりklotho遺伝子の詳細な発現
細胞が明らかになり、同時にnull変異の変異表現型を確認した。Limkinase1ノックアウトは記憶、学習、情動に関する解析を行っているが、顕著な変化が見い出せない。そこで、Limkinase2ノックアウトマウスとの掛け合わせによりダブルノックアウトマウスを作成したが、脳の形態、機能の異常が観察されていない。プレセニリン結合蛋白、STEF1, Klothoホモログについては、染色体遺伝子を分離し、相同組み換えベクターを作製し、ノックアウトマウスの作成を進めているところである。新たな方法の開発を試みており、任意の時期より遺伝子機能を改変する方法が確立されつつある。
血中、尿中にリンの濃度が顕著に高いことから、リンの摂取量を食餌により制御したところ、オスにおいて変異表現型の回復が観察された。また、メスにおいては、リンの摂取制限と亜鉛の添加によりklothoの発現なしに変異症状が回復することが明らかとなった。また、リンの摂取量がklothoの発現に影響することが明らかになった。多彩な老化症状を呈するKlothoマウスをモデルとして、遺伝子素因がその多彩な症状の発症にどのように影響するかを検討した。掛け合わせにより、遺伝的背景の違いが多彩な老化症状の発現に影響を与えることが明らかとなり、最終的にはそれぞれの老化症状の成り立ちに関連する遺伝子素因の遺伝子座を同定し、素因遺伝子を分離する道が開かれた。klotho遺伝子の多型が代謝性疾患とリンクすることが明らかとなった。
STEFが発生途上の神経系において、神経細胞移動や神経突起伸長、あるいはシナプス形成といった動的な過程で何らかの役割を果たしているらしいことが予想されてきている。恐らく、細胞外からの様々なシグナルに応答し、神経細胞内の局所でRac1を活性化させることによって、アクチン細胞骨格系の適切な変化を引き起こしているのであろう。
機能ドメインが明らかになり、それを用いたtwo hybridシステムにより結合する分子の同定を進めており、それらを含めてさらにSTEFの機能について明らかにしていく。
細胞が明らかになり、同時にnull変異の変異表現型を確認した。Limkinase1ノックアウトは記憶、学習、情動に関する解析を行っているが、顕著な変化が見い出せない。そこで、Limkinase2ノックアウトマウスとの掛け合わせによりダブルノックアウトマウスを作成したが、脳の形態、機能の異常が観察されていない。プレセニリン結合蛋白、STEF1, Klothoホモログについては、染色体遺伝子を分離し、相同組み換えベクターを作製し、ノックアウトマウスの作成を進めているところである。新たな方法の開発を試みており、任意の時期より遺伝子機能を改変する方法が確立されつつある。
血中、尿中にリンの濃度が顕著に高いことから、リンの摂取量を食餌により制御したところ、オスにおいて変異表現型の回復が観察された。また、メスにおいては、リンの摂取制限と亜鉛の添加によりklothoの発現なしに変異症状が回復することが明らかとなった。また、リンの摂取量がklothoの発現に影響することが明らかになった。多彩な老化症状を呈するKlothoマウスをモデルとして、遺伝子素因がその多彩な症状の発症にどのように影響するかを検討した。掛け合わせにより、遺伝的背景の違いが多彩な老化症状の発現に影響を与えることが明らかとなり、最終的にはそれぞれの老化症状の成り立ちに関連する遺伝子素因の遺伝子座を同定し、素因遺伝子を分離する道が開かれた。klotho遺伝子の多型が代謝性疾患とリンクすることが明らかとなった。
STEFが発生途上の神経系において、神経細胞移動や神経突起伸長、あるいはシナプス形成といった動的な過程で何らかの役割を果たしているらしいことが予想されてきている。恐らく、細胞外からの様々なシグナルに応答し、神経細胞内の局所でRac1を活性化させることによって、アクチン細胞骨格系の適切な変化を引き起こしているのであろう。
機能ドメインが明らかになり、それを用いたtwo hybridシステムにより結合する分子の同定を進めており、それらを含めてさらにSTEFの機能について明らかにしていく。
結論
加齢に伴う疾患の成り立ちには生活習慣や遺伝的素因が大きく関わっていることが明らかにされつつある。そこで、本研究では関連する遺伝子の同定と機能解析、及びモデル動物の作成を目的として(1)プレセニリン結合蛋白、STEF1, Limkinase1,2のダブルノックアウトなどの神経疾患に関連する新たな遺伝子、及びKlothoホモログのノックアウトマウスの作成、(2)多彩な老化症状を呈するKlothoマウスをモデルとして、発症に影響する遺伝子素因の検討、(3)リンの摂取と変異表現型の関係、(4)klotho遺伝子の多型とリンクする疾患の4点にわたる研究を行い、次の結果をえた。Lim kinase1とLim kinase2とのダブルノックアウトマウスの作成したが、現時点では全く変異を見い出すことができない。プレセニリン結合蛋白、STEF1, Klothoホモログについては、染色体遺伝子を分離し、相同組み換えベクターを作製し、相同組み換えES細胞を分離し、ノックアウトマウスの作成を進めている。特にプレセニリン結合蛋白の強制発現は神経細胞死を抑制し、アルツハイマー脳では発現が著しく減少していることが明かとなり、神経細胞死を抑えるために重用な機能を担っていると推定される。klotho遺伝子座にlacZをノックインしたマウスの解析により詳細な発現細胞の同定、null変異の変異表現型を確認した。リンの摂取量を制限したオスにおいて変異表現型の回復が観察された。また、メスにおいては、リンの摂取制限と亜鉛の添加によりklothoの発現なしに変異症状が回復する。更に、リンの摂取量がklothoの発現に影響することが明らかになった。多彩な老化症状を呈するKlothoマウスをモデルとして、遺伝子素因がその多彩な症状の発症にどのように影響するかを検討した。掛け合わせにより、遺伝的背景の違いが多彩な老化症状の発現に影響を与えることが明らかとなり、最終的にはそれぞれの老化症状の成り立ちに関連する遺伝子素因の遺伝子座を同定し、素因遺伝子を分離する道が開かれた。klotho遺伝子の多型が代謝性疾患とリンクすることが明らかとなった。
公開日・更新日
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