高血圧及び動脈硬化の成因と治療に関わる遺伝子の探索と機能解析

文献情報

文献番号
199900337A
報告書区分
総括
研究課題名
高血圧及び動脈硬化の成因と治療に関わる遺伝子の探索と機能解析
課題番号
-
研究年度
平成11(1999)年度
研究代表者(所属機関)
田辺　忠(国立循環器病センター研究所)
研究分担者(所属機関)
  • 加藤　久雄(国立循環器病センター研究所)
  • 寒川　賢治(国立循環器病センター研究所)
  • 瀧下　修一(国立循環器病センター病院)
  • 沢村　達也(国立循環器病センター研究所)
  • 森崎　裕子(国立循環器病センター研究所)
  • 馬場　俊六(国立循環器病センター病院)
  • 岩井　直温(国立循環器病センター研究所)
  • 荻原　俊男(大阪大学大学院)
研究区分
厚生科学研究費補助金 総合的プロジェクト研究分野 ヒトゲノム・遺伝子治療研究事業
研究開始年度
平成10(1998)年度
研究終了予定年度
平成11(1999)年度
研究費
70,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-

研究報告書（概要版）

研究目的
心血管の機能の破綻から生ずる動脈硬化や高血圧などの成因の解析は、近年の心血管作動性因子とその受容体に関する研究、あるいはリポ蛋白質とその受容体の研究により急速に進歩しており、これらの物質の病態生理学的な研究成果は、多くの循環器疾患患者の救命に繋がって来た。しかし、原発性肺高血圧症や動脈閉塞症など未だに成因や有効な治療法が不明な心血管系の疾患も多い。これまでに、血管は細胞間や臓器間の情報交換に積極的に関与する器官であり、特に血管内皮細胞の機能的な変化が、生体の恒常性維持に重大な影響を与え、高血圧や動脈硬化などの心血管系の疾患を惹起することが本研究分担者らにより示されてきた。これらの機能変化を司る遺伝子に変異を与えた疾患モデル動物を作製し、遺伝子の機能を解析することは、その成因に多因子の関与が予想される循環器疾患の成因の正確な理解と治療法の開発に不可欠である。さらに、これらのモデルでの遺伝子異常を循環器疾患の臨床例に相関出来れば、その成果は循環器疾患の診断と予防に大きな貢献が期待される。特に、心血管機能の異常からの修復に働く遺伝子の探索と解析は、循環器疾患の遺伝子治療に向けての新たな視点から大きな貢献が期待出来る。また、高血圧症は動脈硬化を始めとして多くの病態に深く関わることからその病態、病因の解析と適切な対応は極めて重要である。その発症は複数の遺伝要因と環境要因との共同作用と考えられ複雑であるが、疾患感受性遺伝子の解析が進めば、成果の予知医学としての応用が可能となり、急速に進行する超高齢化社会における朗報となりうる。
研究方法
心血管系の恒常性維持に重要な働きをしている脂質性生理活性物質であるプロスタサイクリン(PGI2)とトロンボキサン(TX)の合成酵素遺伝子欠損マウスの生理的生化学的検査を行った。レクチン様酸化LDL受容体(LOX-1)の過剰発現マウスを作製した。前年度に作製したLOX-1欠損マウスの血清脂質分析と内皮細胞の酸化LDL取込み能を検討した。LOX-1中和抗体を作成し、血小板の活性化とLOX-1への結合との関連を調べた。高ホモシステイン血症の原因となるホモシステインにより血管内皮細胞に誘導される新規遺伝子Herpの発現、プロモータ解析、細胞内局在の検討を行った。血管拡張性の降圧活性を有するアドレノメデュリン(AM)の受容体と考えられるcalcitonin receptor-like receptor (CRLR)/receptor activity -modifying proteins (RAMPs)のマウスcDNAをクローニングし、各種循環器疾患モデルや敗血症の病態モデルマウスにおける受容体の発現と、血中AM濃度、臓器中AM含量、AM mRNA量を調べた。一方、高血圧症など循環器疾患の病因遺伝子の探索に必要なゲノム遺伝子多型情報収集の手法を確立し、候補遺伝子についてSNPの収集を行った。無作為抽出された吹田市一般住民を対象に、国立循環器病センターで頸部超音波検査を行い、動脈硬化とangiotensin converting enzyme(ACE)遺伝子多型の関連を解析した。また関連遺伝子の多型頻度を高血圧群、若年者、老年者間で比較検討した。
(倫理面への配慮)本研究ではヒトを対象とした研究では、国立循環器病センターと滋賀医科大学ではACE遺伝子解析に対して、大阪大学では循環器疾患関連遺伝子解析についてインフォームドコンセントの得られた対象者からの検体のみ用いた。また、実験動物を用いた研究では、実験動物作成、飼育及び保管に関する基準、或いは動物実験に関連する規定に基づき実施すると共に、実験動物愛護に配慮して行った。
結果と考察
1. 遺伝子とその産物の機能解析　PGI2欠損マウスは加齢に伴い腎臓に形態変化を生じ、血中尿素窒素ならびにクレアチニン量の上昇と高い血圧を示す個体が多く認められた。血漿中TXB2とPGE2は、野生型に比べ3-7倍の上昇が認められた。TX合成酵素遺伝子の活性部位を欠損したTX欠損マウスは、止血時間が野生型に較べ約2倍遅延した。モノクロタリン投与肺高血圧症モデルラットの肺にヒトPGI2合成酵素遺伝子を導入した結果、血圧の低下と生存率の向上が認められ、PGI2合成酵素遺伝子による原発性高血圧症治療の期待が高まった。血管で特異的にLOX-1を過剰発現するトランスジェニックマウスを作製した。LOX-1遺伝子欠損マウスではLDLのサイズに変化が生じ、酸化LDLに相当すると考えられるLOX-1リガンド活性も血液中で増加した。抗LOX-1抗体はLOX-1発現細胞や内皮細胞への血小板の結合を抑制し、LOX-1は活性化により血小板表面に露出したフォスファチジルセリンを介して内皮細胞と結合すること、内皮細胞からのエンドセリンの放出も促進し、内皮細胞の活性化も引き起こすことが明らかになった。ホモシステインにより血管内皮細胞で発現が上昇する遺伝子として単離されたHerpは、小胞体ストレス誘発刺激により50倍以上も転写が誘導され、小胞体に局在する分子量54000の膜タンパク質であった。この遺伝子は染色体16q12,2-3に局在する。またプロモータ領域には相加的に働く2つの小胞体ストレス応答エレメントが存在し、Herp はストレス下の細胞の生存に重要な役割を果たしていると考えられる。AM受容体は、CRLRとその発現を補助するRAMPが共に発現することにより構成され、cDNAクローニングの結果、マウスCRLRはアミノ酸配列でヒトおよびラットと約90%、マウスRAMP1、2、3はヒトと50-80%の相同性を示した。CRLRmRNAは全身臓器に広く分布しているのに対し、3種類のRAMPmRNAはそれぞれ特異的な発現分布を示した。敗血症モデルにおいてCRLRとRAMP2は肺での発現が低下し、逆にRAMP3は肺、脾臓、胸腺での発現が著明に増加した。このためAMの作用部位はRAMPの発現分布により決定され、AMの免疫系調節の関与も示唆された。一方、高血圧などにおいて、血中レベルだけでなく心臓や腎組織中でのAMペプチドおよび遺伝子発現レベルが増加していた。また高血圧および心不全モデルでは、腎でのAM調節系は受容体よりもリガンド産生系の変化が主であった。各病態で産生増加したAMは循環ホルモンあるいは局所因子として臓器障害の進行や臓器リモデリングを抑制していると考えられた。
2. 病因遺伝子の探索 効率よいゲノム多様性解析の手法として、多色蛍光プライマーを用いてPCR後SSCP法を行う方法(MF-PCR-SSCP法)およびdHPLC法を検討してSNPのスクリーニング方法を確立した。これらの方法により短期間で17遺伝子のべ35kbの領域について100アレル分、35Mbについてのスクリーニングが可能となり、25個のSNPを同定した。今後これらの手法を用いて高血圧症など循環器疾患の病因遺伝子の探索にあたり、患者におけるSNPの探索、遺伝子型解析を進める。また、見出されたSNPの多くは日本人特有であったことから、積極的に日本人固有の遺伝子検索を推進すべきであると考えられた。ACE遺伝子多型間で高血圧者の率が男性においてのみDD型がII型やID型に較べて有意(p<0.01)に多かった。 頸動脈硬化病変とACE遺伝子多型との間には、有意な関連性のないことが示唆された。血圧の食塩感受性にかかわる可能性があるSA遺伝子のプロモータ領域に、その活性を低下させるTTTAAA挿入欠失変異を見出した。
結論
上記の遺伝子探索と遺伝子改変マウス等を用いた機能解析により本年度は以下の結論が得られた。1) PGI2欠損マウスは、腎における血管障害が引き金となり形態変化を伴う腎障害を発症し、その結果血圧上昇を来すと考えられ、PGI2合成酵素遺伝子は、動脈硬化や高血圧の関連遺伝子となりうる可能性が示唆された。PGI2合成酵素遺伝子による原発性高血圧症の治療の可能性が期待される。2) LOX-1遺伝子ノックアウトマウス、トランスジェニックマウスの作成やLOX-1の中和抗体の作成に成功し、LOX-1の血小板認識能が生理的に重要であることを証明した。3) 小胞体膜に局在するホモシステイン応答遺伝子新規タンパク質Herpは、遺伝子のプロモータ領域に2種の小胞体ストレス応答エレメントを有し、ストレス下の細胞の生存に重要であると考えられた。4) マウスAM受容体の構造および発現解析を行った。敗血症モデルにおいて、AM受容体の発現変化がAMの生理作用に強く影響を与える可能性が示唆された。AMは種々の循環器病態モデルにおいて発現、産生が増加し、特に心臓や腎臓において臓器障害に対する保護作用を担っている可能性が示された。5) 高血圧症など循環器疾患の病因遺伝子の探索を行うにあたり、MF-PCR-SSCP法ならびにdHPLC法により、候補遺伝子の日本人にみられるSNPを効率よく検出する方法を確立した。6) わが国において、頸動脈硬化病変とACE遺伝子多型との間には関連性が認められなかった。7) 遺伝子多型の意義は、実際の疾患の発症や合併症への進展、環境因子との相互作用も含めて検討されるべきであると考えられた。8) 血圧の食塩感受性にかかわる可能性があるSA遺伝子のプロモータ領域に、その活性を低下させるTTTAAA挿入欠失変異を見出した。

公開日・更新日

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