文献情報
文献番号
199900330A
報告書区分
総括
研究課題名
ヒト癌拒絶抗原遺伝子同定と癌ワクチン開発に関する研究
課題番号
-
研究年度
平成11(1999)年度
研究代表者(所属機関)
伊東 恭悟(久留米大学医学部免疫学講座)
研究分担者(所属機関)
- 山名秀明(久留米大学医学部外科学講座)
研究区分
厚生科学研究費補助金 総合的プロジェクト研究分野 ヒトゲノム・遺伝子治療研究事業
研究開始年度
平成10(1998)年度
研究終了予定年度
平成12(2000)年度
研究費
30,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
本研究の主目的はヒトHLA拘束性癌特異的CTL株を作製し、それの認識する癌拒絶抗原遺伝子をクローニングし、上皮性癌患者に対して臨床応用可能な腫瘍特異免疫療法の標的分子を開発することである。本邦において多発する癌、即ち肺癌、消化管癌(食道、胃、大腸癌)、肝癌、頭頚部癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、腎癌及び白血病を主な対象とし、組織型としてはそれらの大部分を占める扁平上皮癌及び腺癌に絞って研究する。上皮性癌は我が国における成人悪性腫瘍の大半を占めるのみでなく世界にも最も頻発する癌である。またHLAとしては本邦でも発現頻度の高いHLA-A24(癌患者の約6割)、HLA-A2(約4割)、及びHLA-A26(約2割)抗原拘束性のCTL認識性癌退縮抗原の同定を目指す。次いでHLA-A11(2割)、-A31(2割弱)、-A33(2割弱)を対象とする。日本人の95%以上は少なくともHLA-A24、-A2、-A26、-A31、-A33のいずれか一方を保有するのみならず、上記HLAアレールは人種をこえて広く認められる。したがって本研究により癌拒絶抗原遺伝子が同定され宿主によって認識されるペプチド抗原分子機構解明に大きく貢献するものと考えられる。さらに本研究で開発された癌ワクチンが臨床応用された場合、世界レベルで、上皮性癌特異免疫療法として活用されるものと考えられる。
研究方法
1) ヒトHLA拘束性癌特異的CTL株を作製し、それの認識する癌拒絶抗原遺伝子をクローニングした。遺伝子クローニングには、T.Boonらの開発したgene-expression cloning法の改良法を用いた。癌腫としては日本人に多発する上皮癌(腺癌及び扁平上皮癌)を主な対象とし、HLAとしてはHLA-クラスⅠ抗原を主対象として、その中で本邦で発現頻度の高いHLA-A24(癌患者の約6割)、HLA-A2(約4割)、HLA-A26(約2割)拘束性のCTL認識性癌退縮抗原とペプチドの同定を実施した。
2) 上記癌拒絶抗原の各種癌における蛋白レベルでの発現は、ポリクローナル抗体とウエスタンブロット法により実施した。mRNAレベルでの発現は、ノーザンブロット法によって解析した。癌種としては肺癌、頭頚部癌,脳腫瘍、食道癌、胃癌、乳癌、肝癌、大腸癌、骨腫瘍、腎癌、子宮癌、白血病及び卵巣癌にて解析した。また上記癌拒絶抗原分子のうち、新規分子の生理的機能を解析した。
3) 上記にて同定した癌拒絶抗原内に存在するCTL株により認識されるペプチド抗原を同定し、それらを合成して癌患者リンパ球よりHLA拘束性キラーT細胞誘導能の有無を解析し、癌ワクチンとしての臨床応用の可能性について基礎的研究を実施した。
4) キラーT細胞の誘導能の明らかなペプチドについては、臨床応用可能なグレードのペプチド(GMPグレード)を米国MPS社に依頼し2～4g作製した。安全性やこれらの精製制度などを確認後、有害事象の有無とキラーT細胞誘導能の有無を主目的として、山名秀明分担研究者を中心として本久留米大学にて各種癌を対象に臨床第Ⅰ相試験を実施中である。
2) 上記癌拒絶抗原の各種癌における蛋白レベルでの発現は、ポリクローナル抗体とウエスタンブロット法により実施した。mRNAレベルでの発現は、ノーザンブロット法によって解析した。癌種としては肺癌、頭頚部癌,脳腫瘍、食道癌、胃癌、乳癌、肝癌、大腸癌、骨腫瘍、腎癌、子宮癌、白血病及び卵巣癌にて解析した。また上記癌拒絶抗原分子のうち、新規分子の生理的機能を解析した。
3) 上記にて同定した癌拒絶抗原内に存在するCTL株により認識されるペプチド抗原を同定し、それらを合成して癌患者リンパ球よりHLA拘束性キラーT細胞誘導能の有無を解析し、癌ワクチンとしての臨床応用の可能性について基礎的研究を実施した。
4) キラーT細胞の誘導能の明らかなペプチドについては、臨床応用可能なグレードのペプチド(GMPグレード)を米国MPS社に依頼し2～4g作製した。安全性やこれらの精製制度などを確認後、有害事象の有無とキラーT細胞誘導能の有無を主目的として、山名秀明分担研究者を中心として本久留米大学にて各種癌を対象に臨床第Ⅰ相試験を実施中である。
結果と考察
1)SART-1ペプチド:SART-1抗原中にHLA-A24拘束性CTLを誘導できるペプチド分子SART-1690-698を同定した。HLA-A26サブタイプの全てにおいてSART-1736-744ペプチドがCTL誘導能を有することを明らかにした。また、腎癌、脳腫瘍、乳癌におけるSART-1抗原の発現を明らかにした。HLA-A24及び-A26扁平上皮癌症例を対象に臨床第Ⅰ相試験を実施中である。有害事象は全く認められず、また0.3mg投与群3例中1例において、癌特異免疫能増強が確認できた。
2)SART-2ペプチド:SART-2遺伝子と同抗原ペプチドを解析した。100kdのSART-2抗原はERに選択的に局在し、扁平上皮癌の殆どと一部の肺癌に発現しており、一方の正常組織では、その蛋白発現が認められないことにより扁平上皮癌ワクチンとして臨床応用可能と判断され、婦人科領域扁平上皮癌に対して臨床第Ⅰ相試験を実施中である。
3)SART-3ペプチド:SART-3遺伝子及び同抗原ペプチドを解析した。一方、各種癌におけるSART-3抗原の発現を明らかにした。また、two-hybrid法によりSART-3蛋白に結合する分子RNPS-1を同定した。RNPS-1分子はRNAの3側からのスプライシングを調節する分子として最近報告されたことより、SART-3はRNAの転写に関与する分子と考えられた。SART-3ペプチドは、大腸癌、乳癌症例を対象に臨床第Ⅰ相臨床試験を実施中である。有害事象は、局所発赤、腫瘍以外は認められず、安全性が確認された。また、0.3mg投与群全例(3例)において癌特異免疫能の誘導、もしくは増強が確認された。
4)サイクロフィリンBペプチド:癌抗原としてのサイクロフィリンB及び同抗原ペプチドを解析した。サイクロフィリンB 91-99 ペプチドは、肺癌症例に対して臨床第Ⅰ相試験中であるが、有害事象は局所発赤以外全く無く、安全性は確認された。また、1mgもしくは3mg投与5例において、CTL誘導もしくは増強が確認された。
5)ART-1ペプチド:ART-1遺伝子と同抗原ペプチドを解明した。新規の核蛋白であるART-4抗原は、肺癌とりわけ腺癌に高発現していることから、肺腺癌ワクチンとして有用と考えられる。
6)ART-4ペプチド:ART-4遺伝子と同抗原ペプチドを解明した。42kdの核蛋白であるART-4抗原は新規の遺伝子によりコードされており、癌細胞にのみ蛋白発現が認められる。ART-4ペプチドは、卵巣癌に対して臨床第Ⅰ相試験を実施中である。
7)SART-5ペプチド:癌拒絶抗原としてSART-5(P1-9)抗原のmRNAレベルでの各種癌における発現と同抗原ペプチドを解明した。P1-9は、serpinのfamilyでありアポトーシスをブロックする機能が知られているが、その蛋白分子由来のペプチドがCTLにより認識されることは、抗腫瘍免疫の分子機構の新知見と考えられる。
8)HLA-A2拘束性癌拒絶抗原遺伝子クローニングとCTLエピトープの同定:大腸癌局所由来HLA-A2拘束性CTL株を樹立し、同CTLの認識する癌拒絶抗原遺伝子をPanc-1腺癌細胞株cDNAライブラリーより12種類(6つの新規を含む)をクローニングし、それらの全塩基配列、各種癌における発現、ペプチド分子などについて解析中である。また上記CTL株を用いて、サイクロフィリンB及びSART-3抗原内に各々2ヶ所HLA-A2拘束性CTLを誘導できるペプチド部分を同定した。
2)SART-2ペプチド:SART-2遺伝子と同抗原ペプチドを解析した。100kdのSART-2抗原はERに選択的に局在し、扁平上皮癌の殆どと一部の肺癌に発現しており、一方の正常組織では、その蛋白発現が認められないことにより扁平上皮癌ワクチンとして臨床応用可能と判断され、婦人科領域扁平上皮癌に対して臨床第Ⅰ相試験を実施中である。
3)SART-3ペプチド:SART-3遺伝子及び同抗原ペプチドを解析した。一方、各種癌におけるSART-3抗原の発現を明らかにした。また、two-hybrid法によりSART-3蛋白に結合する分子RNPS-1を同定した。RNPS-1分子はRNAの3側からのスプライシングを調節する分子として最近報告されたことより、SART-3はRNAの転写に関与する分子と考えられた。SART-3ペプチドは、大腸癌、乳癌症例を対象に臨床第Ⅰ相臨床試験を実施中である。有害事象は、局所発赤、腫瘍以外は認められず、安全性が確認された。また、0.3mg投与群全例(3例)において癌特異免疫能の誘導、もしくは増強が確認された。
4)サイクロフィリンBペプチド:癌抗原としてのサイクロフィリンB及び同抗原ペプチドを解析した。サイクロフィリンB 91-99 ペプチドは、肺癌症例に対して臨床第Ⅰ相試験中であるが、有害事象は局所発赤以外全く無く、安全性は確認された。また、1mgもしくは3mg投与5例において、CTL誘導もしくは増強が確認された。
5)ART-1ペプチド:ART-1遺伝子と同抗原ペプチドを解明した。新規の核蛋白であるART-4抗原は、肺癌とりわけ腺癌に高発現していることから、肺腺癌ワクチンとして有用と考えられる。
6)ART-4ペプチド:ART-4遺伝子と同抗原ペプチドを解明した。42kdの核蛋白であるART-4抗原は新規の遺伝子によりコードされており、癌細胞にのみ蛋白発現が認められる。ART-4ペプチドは、卵巣癌に対して臨床第Ⅰ相試験を実施中である。
7)SART-5ペプチド:癌拒絶抗原としてSART-5(P1-9)抗原のmRNAレベルでの各種癌における発現と同抗原ペプチドを解明した。P1-9は、serpinのfamilyでありアポトーシスをブロックする機能が知られているが、その蛋白分子由来のペプチドがCTLにより認識されることは、抗腫瘍免疫の分子機構の新知見と考えられる。
8)HLA-A2拘束性癌拒絶抗原遺伝子クローニングとCTLエピトープの同定:大腸癌局所由来HLA-A2拘束性CTL株を樹立し、同CTLの認識する癌拒絶抗原遺伝子をPanc-1腺癌細胞株cDNAライブラリーより12種類(6つの新規を含む)をクローニングし、それらの全塩基配列、各種癌における発現、ペプチド分子などについて解析中である。また上記CTL株を用いて、サイクロフィリンB及びSART-3抗原内に各々2ヶ所HLA-A2拘束性CTLを誘導できるペプチド部分を同定した。
結論
計画通りにHLA-A24拘束性扁平上皮癌由来拒絶抗原遺伝子5種類(SART-1～SART-5)及び肺腺癌由来癌拒絶抗原遺伝子3種類(サイクロフィリンB、ART-1、ART-4)の解析と、それらにコードされるペプチドシークエンスの決定及び、それらのin vitroにおけるキラーT細胞誘導能を決定し、予想を超える成果をあげたものと考えられる。さらに、HLA-A2拘束性扁平上皮癌及び腺癌拒絶抗原遺伝子とそれにコードされるペプチドの同定とCTL誘導能の解析においても多くの成果を得た。また、HLA-A24陽性上皮癌症例(肺癌、食道癌、大腸癌、乳癌、子宮癌及び卵巣癌)に対して、本研究により同定された13種類のペプチドを用いて臨床第Ⅰ相試験を実施中である。その詳細は山名分担員からの報告に譲るが、これまでのところ安全性は確認され、またペプチドによる癌特異免疫能の増強が認められるなど順調に経過している。
公開日・更新日
公開日
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更新日
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