文献情報
文献番号
199900328A
報告書区分
総括
研究課題名
老年病・老化に関わる遺伝子と機能解析
課題番号
-
研究年度
平成11(1999)年度
研究代表者(所属機関)
池田 恭治(長寿医療研究センター)
研究分担者(所属機関)
- 北村俊雄(東京大学医科学研究所)
研究区分
厚生科学研究費補助金 総合的プロジェクト研究分野 ヒトゲノム・遺伝子治療研究事業
研究開始年度
平成11(1999)年度
研究終了予定年度
-
研究費
50,000,000円
研究者交替、所属機関変更
-
研究報告書（概要版）
研究目的
老化や老年病の発症には、環境からのストレスあるいは代謝の結果発生する活性酸素などの内因性ストレスに対する抵抗性の減弱が大きく関与している。とりわけWerner症候群や末梢血管拡張性運動失調症(AT)に代表される早老症の原因遺伝子WRNとATMの同定をきっかけに、DNA傷害からゲノムを安定に維持する機構の破綻が老化と密接に関連する可能性が注目されている。我々は、前年度までに、ATMから老化形質発現に至る経路で働くシグナル分子でチェックポイント機構に重要な役割を果たす、ヒトChk1、Cds1遺伝子を同定し、いち早くノックアウトマウスの作成にもとりかかった。今年度は、ノックアウトマウスおよび細胞を用いて、Cds1、Chk1の機能を解析した。また、ストレス応答に重要な役割を演じるNF-_Bを活性化する新規のIKK様のキナーゼ、NAK(NF-_B-activating kinase)を同定したが、今年度はNAKによるNF-_B活性化のメカニズム解明を目的に研究を進めた。一方、分担研究者の北村は、老化や老年病の発症に関わる遺伝子を広く探索・同定するツールとして、レトロウイルスベクターによる発現クローニング法を利用した機能的スクリーニング系の開発を行い、これらの新しい手法を用いていくつかの興味ある新規遺伝子を同定した。
研究方法
1.ゲノム維持機構と老化・老年病
マウスのChk1、Cds1遺伝子を単離し、targetingベクターを作成した上で、ES細胞に導入し、通常の方法に従ってノックアウトマウスを作成した。両ノックアウトマウスとも、p53ノックアウトマウスと交配を行っている。
リコンビナント蛋白は、バキュロウイルスベクターを用いて、昆虫細胞Sf9で発現させた。GST融合蛋白は、pGEXベクターに組み込んで大腸菌で発現させ、グルタチオンカラムで精製した。特異的抗体は、Sf9細胞で合成したリコンビナント蛋白で家兎を免疫し、リコンビナント蛋白をカップルさせたセファロースカラムで精製した。Northern、Western解析、免疫沈降はスタンダードの方法で行った。細胞内局在は、固定した細胞を特異的抗体で処理した後、FITC抱合抗ウサギIgGで染色し、共焦点顕微鏡で観察した。
NAKやIKK_は、293T細胞にtransfectionを行い、kinase assayやimmunoblot解析した。NF-_Bの転写活性およびDNA結合能は、luciferaseとEMSA(electrophoretic mobility shift assay)を用いて測定した。
2.レトロウイルスを利用した発現クローニング法の開発と応用
我々はこれまでに効率の良いレトロウイルスベクター系を開発し、レトロウイルスによる発現クローニング法を樹立してきた。更にPCRによる任意突然変異導入とレトロウイルス発現スクリーニング系を組み合わせることによって、サイトカインレセプターMPLと転写因子STAT5の活性型変異体を同定した(Onishi et al. Blood, 1996; Onishi et al. Mol.Cell.Biol.,1998)。
本実験においてはレトロウイルスベクターを利用したcDNAライブラリーの機能的スクリーニングを基礎として以下の3つの方法論で細胞周期や老化に関与する新規遺伝子の同定を試みた。
(1)全長cDNAライブラリーの機能的スクリーニング(Kitamura et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995)
本年度は、マウス白血病M1細胞のcDNAライブラリーをレトロウイルスベクターで作成し、M1細胞の分化増殖など細胞周期に影響を与える遺伝子の同定を試みた。
(2)レトロウイルスベクターpMX-SSTを利用したシグナルシークエンストラップ法SST-REX(Kojima anda Kitamura, Nature Biotechnology, 1999)。
SST-REX法の樹立には、研究分担者らが以前に同定した恒常的活性型MPL(MPL* : Onishi et al. Blood 1996)を利用した。MPL*は膜貫通部位の点突然変異によってリガンド非存在下でもホモダイマーを形成して細胞に自律増殖能を賦与する。まずMPL*の細胞外部位欠失変異体△MPL*とcDNA断片を融合したライブラリーをウイルスベクターで作成し、ウイルス感染によりIL-3依存性Ba/F3細胞にライブラリーとして導入する。cDNAの断片がシグナル配列を含んでいる場合には、シグナル配列によりcDNA-△MPL*融合蛋白質が細胞膜上に発現され、Ba/F3細胞に自律増殖能を賦与する。感染後、IL-3非存在下で自律増殖するBa/F3クローンを選別し、これらのクローンに挿入されたcDNAをPCRで回収することによって、膜蛋白質および分泌蛋白質のcDNAをスクリーニングする。今年度は、脂肪細胞に分化させた3T3-L1細胞やラット脳のcDNAライブラリーをスクリーニングして新規遺伝子をスクリーニングした。
(3)cDNA-GFPの融合ライブラリーを利用し細胞内局在で蛋白質を同定する方
法FL-REX(Misawa et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000 印刷中)。
FL-REX法では、cDNA断片をGFP(green fluorescent protein)のcDNAと融合させたライブラリーをレトロウイルスベクターpMX-FLを利用して作成する。このライブラリーをNIH3T3細胞に発現させ、GFP融合産物の細胞内局在を蛍光顕微鏡下で観察し、目的の細胞内局在を示す細胞を単離する。単離した細胞からPCRによってレトロウイルスベクターで挿入されているcDNA-GFPを回収し解析すれば、細胞内局在によってcDNAを同定することが可能である。FL-REX法を利用して種々のライブラリーから新規転写因子などを同定した。
マウスのChk1、Cds1遺伝子を単離し、targetingベクターを作成した上で、ES細胞に導入し、通常の方法に従ってノックアウトマウスを作成した。両ノックアウトマウスとも、p53ノックアウトマウスと交配を行っている。
リコンビナント蛋白は、バキュロウイルスベクターを用いて、昆虫細胞Sf9で発現させた。GST融合蛋白は、pGEXベクターに組み込んで大腸菌で発現させ、グルタチオンカラムで精製した。特異的抗体は、Sf9細胞で合成したリコンビナント蛋白で家兎を免疫し、リコンビナント蛋白をカップルさせたセファロースカラムで精製した。Northern、Western解析、免疫沈降はスタンダードの方法で行った。細胞内局在は、固定した細胞を特異的抗体で処理した後、FITC抱合抗ウサギIgGで染色し、共焦点顕微鏡で観察した。
NAKやIKK_は、293T細胞にtransfectionを行い、kinase assayやimmunoblot解析した。NF-_Bの転写活性およびDNA結合能は、luciferaseとEMSA(electrophoretic mobility shift assay)を用いて測定した。
2.レトロウイルスを利用した発現クローニング法の開発と応用
我々はこれまでに効率の良いレトロウイルスベクター系を開発し、レトロウイルスによる発現クローニング法を樹立してきた。更にPCRによる任意突然変異導入とレトロウイルス発現スクリーニング系を組み合わせることによって、サイトカインレセプターMPLと転写因子STAT5の活性型変異体を同定した(Onishi et al. Blood, 1996; Onishi et al. Mol.Cell.Biol.,1998)。
本実験においてはレトロウイルスベクターを利用したcDNAライブラリーの機能的スクリーニングを基礎として以下の3つの方法論で細胞周期や老化に関与する新規遺伝子の同定を試みた。
(1)全長cDNAライブラリーの機能的スクリーニング(Kitamura et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995)
本年度は、マウス白血病M1細胞のcDNAライブラリーをレトロウイルスベクターで作成し、M1細胞の分化増殖など細胞周期に影響を与える遺伝子の同定を試みた。
(2)レトロウイルスベクターpMX-SSTを利用したシグナルシークエンストラップ法SST-REX(Kojima anda Kitamura, Nature Biotechnology, 1999)。
SST-REX法の樹立には、研究分担者らが以前に同定した恒常的活性型MPL(MPL* : Onishi et al. Blood 1996)を利用した。MPL*は膜貫通部位の点突然変異によってリガンド非存在下でもホモダイマーを形成して細胞に自律増殖能を賦与する。まずMPL*の細胞外部位欠失変異体△MPL*とcDNA断片を融合したライブラリーをウイルスベクターで作成し、ウイルス感染によりIL-3依存性Ba/F3細胞にライブラリーとして導入する。cDNAの断片がシグナル配列を含んでいる場合には、シグナル配列によりcDNA-△MPL*融合蛋白質が細胞膜上に発現され、Ba/F3細胞に自律増殖能を賦与する。感染後、IL-3非存在下で自律増殖するBa/F3クローンを選別し、これらのクローンに挿入されたcDNAをPCRで回収することによって、膜蛋白質および分泌蛋白質のcDNAをスクリーニングする。今年度は、脂肪細胞に分化させた3T3-L1細胞やラット脳のcDNAライブラリーをスクリーニングして新規遺伝子をスクリーニングした。
(3)cDNA-GFPの融合ライブラリーを利用し細胞内局在で蛋白質を同定する方
法FL-REX(Misawa et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000 印刷中)。
FL-REX法では、cDNA断片をGFP(green fluorescent protein)のcDNAと融合させたライブラリーをレトロウイルスベクターpMX-FLを利用して作成する。このライブラリーをNIH3T3細胞に発現させ、GFP融合産物の細胞内局在を蛍光顕微鏡下で観察し、目的の細胞内局在を示す細胞を単離する。単離した細胞からPCRによってレトロウイルスベクターで挿入されているcDNA-GFPを回収し解析すれば、細胞内局在によってcDNAを同定することが可能である。FL-REX法を利用して種々のライブラリーから新規転写因子などを同定した。
結果と考察
1.ゲノム安定性維持機構と老化・老年病
(1)Chk1 KOマウスの作成とChk1キナーゼのin vivoにおける機能解析
我々は、昨年度までの研究で、ヒトChk1遺伝子をクローニングし、細胞周期特異的に発現することを報告した(Kaneko Y et al. Oncogene 1999)。引き続きChk1キナーゼの個体レベルにおける機能を解明する目的でノックアウトマウスを作成した。Chk1-/-マウスは誕生せず、embryonic lethalであることが判明した。さらに胎生期をさかのぼって調べたところ、胎生7.5日においても-/- embryoは生存せず、胎生3.5日にはメンデルの法則から予測される1:2:1の割合で+/+、+/-、-/-が認められたことから、胎生3.5日と7.5日の間に死亡するものと結論した。
初期胚のDNAをDAPIで染色したところ、+/-に比較して-/- embryoでは核の凝縮と断片化が著名であった。胎生期3.5日のblastocystをin vitroで4日間培養し観察すると、-/- embryoは正常にhatchしtrophoblast giant cellも認められた。一方、将来胎仔になるinner cell mass(ICM)はまったく発育しなかった。以上の結果は、初期のembryoの発育にChk1が必須の役割を果たすことを示唆する。次にChk1 -/- embryoの死亡の原因を、チェックポイント機能との関連で解析した。AphidicolinでDNA合成を阻害すると、-/-における核の断片化がさらに増強したことから、複製停止に対するチェックポイント機構が-/- embryoで欠損している可能性が考えられた。そこで、aphidicolinでDNA合成を阻害した後、nocodazolを加えM期の進行をブロックした状態で、M期のマーカーであるリン酸化ヒストンH3に対する特異的抗体で染色した。+/+および+/- embryoでは、複製チェックポイントが正常に働いてリン酸化ヒストンH3がまったく認められなかったのに対して、-/- embryoではかなりの割合でリン酸化ヒストンH3が染色され、複製が停止したにもかかわらず異常にM期に進入したものと解釈される。実際、ヒト正常線維芽細胞をaphidicolinあるいはhydroxyurea(HU)で処理してDNA合成をブロックすると、Chk1蛋白のリン酸化によるバンドシフトが認められたことから、複製停止に反応してhChk1がリン酸化を受けて活性化される可能性が考えられた。以上の成績をまとめると、Chk1はin vitroのみならずin vivoにおいても複製チェックポイントに関わっており、Chk1 -/-マウスでは、複製が完全に終了する前にM期へと進行した結果核の断裂化を起こしlethalになるものと理解される。
本来Chk1は酵母の系において、DNA傷害チェックポイントに関わっていることが示されており、我々もChk1 KO embryoを用いて電離放射線や紫外線照射に対する反応を検討した。その結果、aphidicolinの場合と同様に、電離放射線や紫外線を当ててDNA傷害を起こすと、Chk1 +/+および+/- embryoではG2チェックポイントが正常に作動したが、-/- embryoにおいてはチェックポイント機構が作動せず、M期に進行してしまい、リン酸化ヒストンH3が検出された。したがって、Chk1は、DNA複製の停止やDNAの傷害に対して、修復などを作動させゲノムのintegrityを保つために細胞周期を一旦停止させるチェックポイント制御にきわめて重要な役割を果たしていることが明らかになった(Takai H, Tominaga K et al. Nature Cell Biol in revision)。あとで述べるように、Cds1(Chk2)もDNA傷害チェックポイントに関わっているが、Chk1 KOマウスが胎生致死であることから、少なくとも胎生初期の細胞周期がきわめて短い状況では、Chk1機能をChk2(Cds1)が相補できないものと考えられる。また、最近ATMファミリーのATRノックアウトマウスが作成され、Chk1 KOと同じく胎生早期に致死となることが報告されている(Genes & Dev 2000)ことと考え合わせ、あるストレスに対してはChk1がATRの下流で働いている可能性が考えられる。Chk1 KOマウスが胎生致死となることから、老化におけるChk1キナーゼの役割はホモ
マウスを用いては解析できなくなったが、現在ヘテロマウスに低用量の電離放射線を照射し、その後の寿命や発癌に対する影響を追跡調査中である。また、Cre-lop P系を用いた組織特異的ノックアウトマウスも作成中であり、ある特定の組織におけるChk1の役割を解析する予定である。
(2)ヒトCds1キナーゼの機能解析
我々は昨年度の研究で、ヒトCds1遺伝子をクローニングし、DNA傷害に対するチェックポイント機構に関わっていることを明らかにした(Tominaga K, Morisaki H et al. J Biol Chem 1999)。hCds1蛋白は電離放射線や紫外線によるDNA傷害に反応してリン酸化を受け、活性化されることを明らかにした。活性化hCds1はCdc25Cの216番目のセリン残基をリン酸化し、このフォスファターゼを不活化することにより、Cdc2を不活化し細胞周期をG2期で停止させるものと理解される。
重要なことに、AT由来の細胞においては、電離放射線に対するhCds1のリン酸化は特異的に障害されており、これがAT細胞における放射線線感受性の分子基盤になっていることが示された。
さらに、hCds1の発現がp53によって制御されているという興味深い成績も得た(Tominaga K, Morisaki H et al. J Biol Chem 1999)。すなわち、hCds1の発現はp53によって負に制御されており、p53機能が失われてG1チェックポイント機構が働かない細胞では代償的にCds1の発現が誘導され、G2期のDNA傷害チェックポイントに重要な役割を果たしていることが示唆された。p53機能を欠失した癌細胞が、抗癌剤やX線治療に抵抗性を示す機序にCds1の代償作用が関与していることも考えられ、hCds1は新たな癌治療のターゲットとなる可能性がある。
本年度はCds1の個体における機能を解明する目的で、ノックアウマウスを作成した。ヘテロマウスは、外見上wild typeとまったく変化なく、p53との機能的なinteractionを見るために、すでにp53 KOマウスと交配を開始している。また、Cds1 -/-のES細胞を樹立しており、ES細胞ではp53が機能していないため、放射線照射に対してG1 arrestが起こらないが、G2 arrestはCds1 -/-細胞においても認められたことから、Cds1以外の遺伝子がG2 checkpointに関わっている可能性がある。さらに、13.5日のembryoからCds1 -/- MEF(mouse embryo fibroblast)を樹立し、現在checkpoint機能、p53のリン酸化などを解析中である。Cds1 -/-マウスは、3月末に生まれる予定であるが、Cds1 -/- MEFの経験から、Chk1 KOと異なり、Chk2(Cds1)KOマウスは少なくとも胎生13.5日までは生存していることが確実である。
(3)IKKをリン酸化しNF-_Bを活性化する新規キナーゼ、NAKの同定
昨年の研究で我々は、I_Bキナーゼ(IKK)に類似したキナーゼドメイン、ロイシンジッパーモチーフを有する新規遺伝子NAK(NF-_B-activating kinase)をクローニングした。NAKのI___およびI___とのホモロジーは約30-50%である。NAKの組織分布をNorthernブロットで解析したところ、多くの組織において恒常的に発現し、なかでも精巣と骨格筋
においてとりわけ高い発現が観察された。
本年度は、NAKによるNF-_B活性化のメカニズムの解明を試みた。NAKは、in vivoにおいてI_Bのセリン32をリン酸化し、これはdominant negative IKK_によって抑制されたことより、NAKはIKK_を介してI_Bをリン酸化することが示唆された。In vitroでは、NAKは、I_Bのセリン36はリン酸化したが、セリン32はリン酸化しなかった。Wild type NAKは、IKK_のactivation loopのセリン残基をリン酸化したが、kinase inactive NAKはしなかった。
以上の結果より、NAKはIKKとしてではなく、IKKをリン酸化するキナーゼである可能性がより考えられた。実際、recombinant NAKは不活性型のIKK complexを活性化するが、p38 MAP kinaseやJNKは活性化しないことがわかった。さらに、NAKはIKK_と共発現すると、レポーターassayで測定したNF-_Bの転写機能とDNA結合能を著名に増強することが示された。IKK_によるNF-_Bの転写活性化は、NAKによって阻害されなかったが、NAKによる活性化はdominant negative IKK_によって抑制されたことから、___はIKK_の上流で機能すると結論づけられた。実際、IKK_____細胞では___によるNF-_B活性化が障害されていた。NAKを活性化する細胞外シグナルについては今後の詳細な検討が必要であるが、これまでの解析からPKC_の下流で働くことが示唆された。
生物は、紫外線、電離放射線、微生物による感染などの外的ストレスや環境の変化に対応しながら生存する能力を獲得しており、老化の原因として、このようなストレスに対して生体のホメオスタシスを維持する機能の低下が大きく関わっているものと考えられる。なかでも、NF-_Bは、外界からのさまざまな刺激に応答してターゲット遺伝子の転写を制御する多彩な因子であり、NAKはNF-_Bを活性化する新たな経路として注目される。
2.レトロウイルスを利用した発現クローニング法の開発と応用
以下に3つのアプローチによって新規遺伝子をクローニングする方法を開発した。
(1)蛋白質本来の機能を指標としたスクリーニング法による遺伝子の発現クリーニング 研究分担者が、レトロウイルスを利用した発現クローニング法で分化を誘導する遺伝子として単離したcDNAはRac/cdc42特異的GAPであった(Kawashima et al. 論文投稿中)。 部分的配列がヒトでMgcRacGAPとして発表されていたが、分担者のグループでクローニングしたマウスおよびヒトのMgcRacGAPは発表されているものよりN末端が約100アミノ酸長く、完全長のものと思われた。この100アミノ酸の部分は、ミオシン様ドメインで後述のようにMgcRacGAPの作用に重要であった。ヒト白血病細胞株HL60にMgcRacGAPを過剰発現すると増殖が抑制され、マクロファージ系細胞に分化した。しかしながら内因性MgcRacGAPの発現は逆に細胞の増殖速度と正の相関を有する場合が多く、HL60やM1がTPAやIL6に反応してマクロファージに分化して増殖しなくなると内因性MgcRacGAPの発現は消失する。またMgcRacGAPを過剰発現した場合、細胞増殖が抑制されるとともに多核の細胞が出現することも観察された。これらの実験結果から、MgcRacGAPが細胞周期のG2/M期において重要な働きをする可能性を考えた。そこでHela細胞で細胞周期を同期して、MgcRacGAPの発現量の変化を調べたところ、予想どおり細胞周期G2/M期に有意に高いことが判明した。さらにMgcRacGAPのN末端の欠失変異体や、GAP活性陰性の変異体を強制発現すると多核の細胞の出現頻度が高まった。最近、MgcRacGAPに対する抗体を作成し細胞内局在を調べたところ、染色体、紡錘体、収縮輪などに発現し、細胞周期M期でダイナミックな動きをすることが判明した(Hirose et al. 論文準備中)。また細胞周期によってMgcRacGAPのゲル上の見かけの大きさが変化することから、MgcRacGAPがM期のチェックポイントに働くと考えられるセリン/スレオニンリン酸化酵素Chk-1やCds-1の基質となる可能性も考え、今後研究代表者のグループと共に解析を行う予定である。
(2)SST-REX法による膜蛋白質および分泌蛋白質の同定
SST-REX法を利用して、各種細胞から新規のサイトカインレセプター、サイトカイン様分子などをクローニングし解析中であるが、老化に関連する可能性のあるものとして脂肪細胞から同定した4種類の新規分子およびラット脳から同定した新規TNFレセプターファミリー分子がある。
3T3-L1細胞から同定した新規の膜蛋白質あるいは分泌蛋白質7分子のうち、4つは脂肪細胞の分化に伴いその発現が増加する分子であった。そのうち1つの分子は皮下脂肪に較べ内臓脂肪での発現が有意に高く、成人病発症との関係あるいは相関に興味が持たれる。現在までにこれら4分子の全長cDNAをほぼ取得し、cDNAの構造解析を行っている。
一方、脳からクローニングしたTNFレセプターファミリーに属する新規レセプター分子Troyは、リガンドは現時点では不明だが、表皮細胞に限局した特徴的な発現分布を示すため注目している。Troyは脳の神経上皮細胞、皮膚、眼球結膜、胃粘膜上皮、気管上皮など、上皮細胞に特異的に発現されている。最近報告された毛根に特異的発現を示すEdarと呼ばれるTNFレセプターファミリー分子と相同性を示す点も興味を引く。Edarは毛根に発現していることが報告されているが、Troyもまた毛根に発現していることを最近確認した。2つのレセプターの機能の関連性などに興味が持たれる。さらにTroy遺伝子の染色体上の位置が、表皮や毛に異常のあるマウス遺伝病Wc (waved coat)の遺伝子座の非常に近くに存在し、Troy遺伝子自体がWcの原因遺伝子である可能性もある。今後、脱毛、皮膚の退縮など、老化との関係も含めてTroyの機能を調べる予定である。現在、Troyのリガンドの探索を進めるのと並行して可溶型Troyを過剰発現するトランスジェニックマウスを作成し、Troyの機能解析をめざしている。
(3)FL-REX法の開発と応用
本年度はGFP融合蛋白質を利用して、細胞内局在で蛋白質のcDNAをクローニングする方法FL-REX法(Misawa et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 印刷中)を樹立した。この方法を利用して、細胞周期のM期においてダイナミックに動く蛋白質を同定し、M期のチェックポイントおよび進行のメカニズムの研究を展開することを試みている。しかしながら、実験に使用しているNIH3T3細胞がM期において細胞が丸く浮き上がるような形態になり、細胞内部のGFPの局在が判定しにくいという技術的な問題点が残されている。現在までにFL-REX法で新規転写因子様分子を同定し解析中であるが、老化関連あるいは細胞周期関連遺伝子の同定には至っていない。
レトロウイルスを利用した発現クローニング法を工夫して、蛋白質の機能・性質を指標にcDNAをクローニングするという研究の流れのなかで、成人病・老化・細胞周期に関与する可能性がある新規遺伝子を複数同定し、その機能を解析中である。
HL60細胞のマクロファージ系細胞への分化を誘導する分子として同定したMgcRacGAPは、現在までの解析から、細胞分裂M期の進行に重要な遺伝子であることが示唆されている。この分子の強制発現が増殖を抑制し、分化を誘導することと、M期の進行との関係に興味が持たれる。また、本年度樹立したFL-REX法をさらに進展させ、細胞外からの特定の刺激(サイトカイン刺激、UV照射など)に反応してその局在が変化する蛋白質を同定するという方向の、より蛋白質の機能を考えたアプローチを取り入れていく予定である。この実験系がうまく動けば、UV照射後のDNA修復に関与するシグナル伝達の研究などにユニークなアプローチができることが予想され、研究代表者がATM、Chk-1、Cds-1を中心に展開しているM期のチェックポイントの研究とも、うまく相補しあうことが期待できる。
(1)Chk1 KOマウスの作成とChk1キナーゼのin vivoにおける機能解析
我々は、昨年度までの研究で、ヒトChk1遺伝子をクローニングし、細胞周期特異的に発現することを報告した(Kaneko Y et al. Oncogene 1999)。引き続きChk1キナーゼの個体レベルにおける機能を解明する目的でノックアウトマウスを作成した。Chk1-/-マウスは誕生せず、embryonic lethalであることが判明した。さらに胎生期をさかのぼって調べたところ、胎生7.5日においても-/- embryoは生存せず、胎生3.5日にはメンデルの法則から予測される1:2:1の割合で+/+、+/-、-/-が認められたことから、胎生3.5日と7.5日の間に死亡するものと結論した。
初期胚のDNAをDAPIで染色したところ、+/-に比較して-/- embryoでは核の凝縮と断片化が著名であった。胎生期3.5日のblastocystをin vitroで4日間培養し観察すると、-/- embryoは正常にhatchしtrophoblast giant cellも認められた。一方、将来胎仔になるinner cell mass(ICM)はまったく発育しなかった。以上の結果は、初期のembryoの発育にChk1が必須の役割を果たすことを示唆する。次にChk1 -/- embryoの死亡の原因を、チェックポイント機能との関連で解析した。AphidicolinでDNA合成を阻害すると、-/-における核の断片化がさらに増強したことから、複製停止に対するチェックポイント機構が-/- embryoで欠損している可能性が考えられた。そこで、aphidicolinでDNA合成を阻害した後、nocodazolを加えM期の進行をブロックした状態で、M期のマーカーであるリン酸化ヒストンH3に対する特異的抗体で染色した。+/+および+/- embryoでは、複製チェックポイントが正常に働いてリン酸化ヒストンH3がまったく認められなかったのに対して、-/- embryoではかなりの割合でリン酸化ヒストンH3が染色され、複製が停止したにもかかわらず異常にM期に進入したものと解釈される。実際、ヒト正常線維芽細胞をaphidicolinあるいはhydroxyurea(HU)で処理してDNA合成をブロックすると、Chk1蛋白のリン酸化によるバンドシフトが認められたことから、複製停止に反応してhChk1がリン酸化を受けて活性化される可能性が考えられた。以上の成績をまとめると、Chk1はin vitroのみならずin vivoにおいても複製チェックポイントに関わっており、Chk1 -/-マウスでは、複製が完全に終了する前にM期へと進行した結果核の断裂化を起こしlethalになるものと理解される。
本来Chk1は酵母の系において、DNA傷害チェックポイントに関わっていることが示されており、我々もChk1 KO embryoを用いて電離放射線や紫外線照射に対する反応を検討した。その結果、aphidicolinの場合と同様に、電離放射線や紫外線を当ててDNA傷害を起こすと、Chk1 +/+および+/- embryoではG2チェックポイントが正常に作動したが、-/- embryoにおいてはチェックポイント機構が作動せず、M期に進行してしまい、リン酸化ヒストンH3が検出された。したがって、Chk1は、DNA複製の停止やDNAの傷害に対して、修復などを作動させゲノムのintegrityを保つために細胞周期を一旦停止させるチェックポイント制御にきわめて重要な役割を果たしていることが明らかになった(Takai H, Tominaga K et al. Nature Cell Biol in revision)。あとで述べるように、Cds1(Chk2)もDNA傷害チェックポイントに関わっているが、Chk1 KOマウスが胎生致死であることから、少なくとも胎生初期の細胞周期がきわめて短い状況では、Chk1機能をChk2(Cds1)が相補できないものと考えられる。また、最近ATMファミリーのATRノックアウトマウスが作成され、Chk1 KOと同じく胎生早期に致死となることが報告されている(Genes & Dev 2000)ことと考え合わせ、あるストレスに対してはChk1がATRの下流で働いている可能性が考えられる。Chk1 KOマウスが胎生致死となることから、老化におけるChk1キナーゼの役割はホモ
マウスを用いては解析できなくなったが、現在ヘテロマウスに低用量の電離放射線を照射し、その後の寿命や発癌に対する影響を追跡調査中である。また、Cre-lop P系を用いた組織特異的ノックアウトマウスも作成中であり、ある特定の組織におけるChk1の役割を解析する予定である。
(2)ヒトCds1キナーゼの機能解析
我々は昨年度の研究で、ヒトCds1遺伝子をクローニングし、DNA傷害に対するチェックポイント機構に関わっていることを明らかにした(Tominaga K, Morisaki H et al. J Biol Chem 1999)。hCds1蛋白は電離放射線や紫外線によるDNA傷害に反応してリン酸化を受け、活性化されることを明らかにした。活性化hCds1はCdc25Cの216番目のセリン残基をリン酸化し、このフォスファターゼを不活化することにより、Cdc2を不活化し細胞周期をG2期で停止させるものと理解される。
重要なことに、AT由来の細胞においては、電離放射線に対するhCds1のリン酸化は特異的に障害されており、これがAT細胞における放射線線感受性の分子基盤になっていることが示された。
さらに、hCds1の発現がp53によって制御されているという興味深い成績も得た(Tominaga K, Morisaki H et al. J Biol Chem 1999)。すなわち、hCds1の発現はp53によって負に制御されており、p53機能が失われてG1チェックポイント機構が働かない細胞では代償的にCds1の発現が誘導され、G2期のDNA傷害チェックポイントに重要な役割を果たしていることが示唆された。p53機能を欠失した癌細胞が、抗癌剤やX線治療に抵抗性を示す機序にCds1の代償作用が関与していることも考えられ、hCds1は新たな癌治療のターゲットとなる可能性がある。
本年度はCds1の個体における機能を解明する目的で、ノックアウマウスを作成した。ヘテロマウスは、外見上wild typeとまったく変化なく、p53との機能的なinteractionを見るために、すでにp53 KOマウスと交配を開始している。また、Cds1 -/-のES細胞を樹立しており、ES細胞ではp53が機能していないため、放射線照射に対してG1 arrestが起こらないが、G2 arrestはCds1 -/-細胞においても認められたことから、Cds1以外の遺伝子がG2 checkpointに関わっている可能性がある。さらに、13.5日のembryoからCds1 -/- MEF(mouse embryo fibroblast)を樹立し、現在checkpoint機能、p53のリン酸化などを解析中である。Cds1 -/-マウスは、3月末に生まれる予定であるが、Cds1 -/- MEFの経験から、Chk1 KOと異なり、Chk2(Cds1)KOマウスは少なくとも胎生13.5日までは生存していることが確実である。
(3)IKKをリン酸化しNF-_Bを活性化する新規キナーゼ、NAKの同定
昨年の研究で我々は、I_Bキナーゼ(IKK)に類似したキナーゼドメイン、ロイシンジッパーモチーフを有する新規遺伝子NAK(NF-_B-activating kinase)をクローニングした。NAKのI___およびI___とのホモロジーは約30-50%である。NAKの組織分布をNorthernブロットで解析したところ、多くの組織において恒常的に発現し、なかでも精巣と骨格筋
においてとりわけ高い発現が観察された。
本年度は、NAKによるNF-_B活性化のメカニズムの解明を試みた。NAKは、in vivoにおいてI_Bのセリン32をリン酸化し、これはdominant negative IKK_によって抑制されたことより、NAKはIKK_を介してI_Bをリン酸化することが示唆された。In vitroでは、NAKは、I_Bのセリン36はリン酸化したが、セリン32はリン酸化しなかった。Wild type NAKは、IKK_のactivation loopのセリン残基をリン酸化したが、kinase inactive NAKはしなかった。
以上の結果より、NAKはIKKとしてではなく、IKKをリン酸化するキナーゼである可能性がより考えられた。実際、recombinant NAKは不活性型のIKK complexを活性化するが、p38 MAP kinaseやJNKは活性化しないことがわかった。さらに、NAKはIKK_と共発現すると、レポーターassayで測定したNF-_Bの転写機能とDNA結合能を著名に増強することが示された。IKK_によるNF-_Bの転写活性化は、NAKによって阻害されなかったが、NAKによる活性化はdominant negative IKK_によって抑制されたことから、___はIKK_の上流で機能すると結論づけられた。実際、IKK_____細胞では___によるNF-_B活性化が障害されていた。NAKを活性化する細胞外シグナルについては今後の詳細な検討が必要であるが、これまでの解析からPKC_の下流で働くことが示唆された。
生物は、紫外線、電離放射線、微生物による感染などの外的ストレスや環境の変化に対応しながら生存する能力を獲得しており、老化の原因として、このようなストレスに対して生体のホメオスタシスを維持する機能の低下が大きく関わっているものと考えられる。なかでも、NF-_Bは、外界からのさまざまな刺激に応答してターゲット遺伝子の転写を制御する多彩な因子であり、NAKはNF-_Bを活性化する新たな経路として注目される。
2.レトロウイルスを利用した発現クローニング法の開発と応用
以下に3つのアプローチによって新規遺伝子をクローニングする方法を開発した。
(1)蛋白質本来の機能を指標としたスクリーニング法による遺伝子の発現クリーニング 研究分担者が、レトロウイルスを利用した発現クローニング法で分化を誘導する遺伝子として単離したcDNAはRac/cdc42特異的GAPであった(Kawashima et al. 論文投稿中)。 部分的配列がヒトでMgcRacGAPとして発表されていたが、分担者のグループでクローニングしたマウスおよびヒトのMgcRacGAPは発表されているものよりN末端が約100アミノ酸長く、完全長のものと思われた。この100アミノ酸の部分は、ミオシン様ドメインで後述のようにMgcRacGAPの作用に重要であった。ヒト白血病細胞株HL60にMgcRacGAPを過剰発現すると増殖が抑制され、マクロファージ系細胞に分化した。しかしながら内因性MgcRacGAPの発現は逆に細胞の増殖速度と正の相関を有する場合が多く、HL60やM1がTPAやIL6に反応してマクロファージに分化して増殖しなくなると内因性MgcRacGAPの発現は消失する。またMgcRacGAPを過剰発現した場合、細胞増殖が抑制されるとともに多核の細胞が出現することも観察された。これらの実験結果から、MgcRacGAPが細胞周期のG2/M期において重要な働きをする可能性を考えた。そこでHela細胞で細胞周期を同期して、MgcRacGAPの発現量の変化を調べたところ、予想どおり細胞周期G2/M期に有意に高いことが判明した。さらにMgcRacGAPのN末端の欠失変異体や、GAP活性陰性の変異体を強制発現すると多核の細胞の出現頻度が高まった。最近、MgcRacGAPに対する抗体を作成し細胞内局在を調べたところ、染色体、紡錘体、収縮輪などに発現し、細胞周期M期でダイナミックな動きをすることが判明した(Hirose et al. 論文準備中)。また細胞周期によってMgcRacGAPのゲル上の見かけの大きさが変化することから、MgcRacGAPがM期のチェックポイントに働くと考えられるセリン/スレオニンリン酸化酵素Chk-1やCds-1の基質となる可能性も考え、今後研究代表者のグループと共に解析を行う予定である。
(2)SST-REX法による膜蛋白質および分泌蛋白質の同定
SST-REX法を利用して、各種細胞から新規のサイトカインレセプター、サイトカイン様分子などをクローニングし解析中であるが、老化に関連する可能性のあるものとして脂肪細胞から同定した4種類の新規分子およびラット脳から同定した新規TNFレセプターファミリー分子がある。
3T3-L1細胞から同定した新規の膜蛋白質あるいは分泌蛋白質7分子のうち、4つは脂肪細胞の分化に伴いその発現が増加する分子であった。そのうち1つの分子は皮下脂肪に較べ内臓脂肪での発現が有意に高く、成人病発症との関係あるいは相関に興味が持たれる。現在までにこれら4分子の全長cDNAをほぼ取得し、cDNAの構造解析を行っている。
一方、脳からクローニングしたTNFレセプターファミリーに属する新規レセプター分子Troyは、リガンドは現時点では不明だが、表皮細胞に限局した特徴的な発現分布を示すため注目している。Troyは脳の神経上皮細胞、皮膚、眼球結膜、胃粘膜上皮、気管上皮など、上皮細胞に特異的に発現されている。最近報告された毛根に特異的発現を示すEdarと呼ばれるTNFレセプターファミリー分子と相同性を示す点も興味を引く。Edarは毛根に発現していることが報告されているが、Troyもまた毛根に発現していることを最近確認した。2つのレセプターの機能の関連性などに興味が持たれる。さらにTroy遺伝子の染色体上の位置が、表皮や毛に異常のあるマウス遺伝病Wc (waved coat)の遺伝子座の非常に近くに存在し、Troy遺伝子自体がWcの原因遺伝子である可能性もある。今後、脱毛、皮膚の退縮など、老化との関係も含めてTroyの機能を調べる予定である。現在、Troyのリガンドの探索を進めるのと並行して可溶型Troyを過剰発現するトランスジェニックマウスを作成し、Troyの機能解析をめざしている。
(3)FL-REX法の開発と応用
本年度はGFP融合蛋白質を利用して、細胞内局在で蛋白質のcDNAをクローニングする方法FL-REX法(Misawa et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 印刷中)を樹立した。この方法を利用して、細胞周期のM期においてダイナミックに動く蛋白質を同定し、M期のチェックポイントおよび進行のメカニズムの研究を展開することを試みている。しかしながら、実験に使用しているNIH3T3細胞がM期において細胞が丸く浮き上がるような形態になり、細胞内部のGFPの局在が判定しにくいという技術的な問題点が残されている。現在までにFL-REX法で新規転写因子様分子を同定し解析中であるが、老化関連あるいは細胞周期関連遺伝子の同定には至っていない。
レトロウイルスを利用した発現クローニング法を工夫して、蛋白質の機能・性質を指標にcDNAをクローニングするという研究の流れのなかで、成人病・老化・細胞周期に関与する可能性がある新規遺伝子を複数同定し、その機能を解析中である。
HL60細胞のマクロファージ系細胞への分化を誘導する分子として同定したMgcRacGAPは、現在までの解析から、細胞分裂M期の進行に重要な遺伝子であることが示唆されている。この分子の強制発現が増殖を抑制し、分化を誘導することと、M期の進行との関係に興味が持たれる。また、本年度樹立したFL-REX法をさらに進展させ、細胞外からの特定の刺激(サイトカイン刺激、UV照射など)に反応してその局在が変化する蛋白質を同定するという方向の、より蛋白質の機能を考えたアプローチを取り入れていく予定である。この実験系がうまく動けば、UV照射後のDNA修復に関与するシグナル伝達の研究などにユニークなアプローチができることが予想され、研究代表者がATM、Chk-1、Cds-1を中心に展開しているM期のチェックポイントの研究とも、うまく相補しあうことが期待できる。
結論
1.ATMの下流で働き、ゲノム安定性維持機構に関わるチェックポイント遺伝子、Chk1、Cds1遺伝子が、ノックアウトマウスにおける解析などから、複製の停止やDNAの傷害に反応して、細胞周期の進行を制御していることを明らかにした。
2.生体のストレス応答に重要な役割を果たすNF-_Bを活性化する新たな経路を同定した。
3.レトロウイルスを利用した発現クローニング法を開発した。
2.生体のストレス応答に重要な役割を果たすNF-_Bを活性化する新たな経路を同定した。
3.レトロウイルスを利用した発現クローニング法を開発した。
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